組蛋白乙?；瘜撬栝g充質干細胞微環(huán)境適應性的調控作用及機制.pdf

1、骨髓間充質干細胞(BMSCs)是治療括約肌功能障礙型(ISD)壓力性尿失禁的理想細胞,臨床上把BMSCs移植到尿失禁患者的尿道周圍,希望通過成體組織細胞對BMSCs的誘導,使干細胞發(fā)生向相應成體細胞的分化,以治療受損肌肉的排尿功能障礙。然而,至今為止該療法并沒有獲得預期的療效,究其原因是BMSCs誘導分化的機制研究較少,很多關鍵性的問題沒有解決直接影響著干細胞在臨床上的治療效果。
　　前期的一些實驗中可以觀察到在體外膀胱平滑肌細胞

2、的微環(huán)境中BMSCs可向平滑肌細胞的表型分化,提示參與干細胞定向分化的信號可能存在于干細胞生存的微環(huán)境中,通過相應的信號轉導通路,啟動干細胞的基因在時空上特異性表達,合成特異性蛋白質,從而使細胞在功能、結構等方面發(fā)生不同改變。微環(huán)境之所以能夠精密的調控干細胞向特定細胞分化,關鍵因素就是干細胞對其微環(huán)境的適應性以及微環(huán)境對干細胞的潛在影響。因此,針對干細胞在微環(huán)境中的適應性對于全面及清楚的認識干細胞分化情況具有非常重要的理論意義,但是到目

3、前為止,與干細胞微環(huán)境適應性有關的具體機制仍不清楚。
　　因此研究干細胞在體內外微環(huán)境誘導下的適應性的調控變化及機制顯得十分重要。近幾年來組蛋白乙?；揎棇Ω杉毎只挠绊懸鹆巳藗儚V泛關注,組蛋白乙?；赡苁歉杉毎h(huán)境適應性中重要的胞內信號調控事件,染色質核小體組蛋白可以通過共價修飾而發(fā)生乙?；?、甲基化和磷酸化,其中與特異性基因轉錄調控關系最為密切的是組蛋白的乙酰化修飾,通過染色質水平調節(jié)DNA構型疏密,并由染色質不同位點組蛋

4、白的乙酰化修飾構成了多種多樣的“組蛋白密碼”。一般而言,乙酰化的染色質與基因轉錄激活有關,相反的,去乙?；娜旧|與基因轉錄抑制相關,啟動子附近的組蛋白乙?；缴呖捎绊懚喾N生物的可誘導基因的轉錄起始。因而在真核細胞中,組蛋白乙?；?去乙?；瘜θ旧|結構及基因轉錄的調控是一個多層次、多步驟的復雜過程。
　　本實驗取材于3周齡雌性SD大鼠,分別采用密度梯度離心法和膠原酶消化法,分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs;并模擬體內盆底環(huán)境,

5、體外構建膀胱平滑肌與BMSCs接觸培養(yǎng)體系,建立間充質干細胞向平滑肌細胞分化模型,旨在研究組蛋白乙?；揎椩贐MSCs向平滑肌分化的意義以及膀胱平滑肌微環(huán)境誘導BMSCs適應性的調控機制,主要實驗方法及結果如下:
　　一、細胞培養(yǎng)鑒定與共培養(yǎng)模型的建立
　　1.大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)的分離與培養(yǎng)無菌操作下取3周齡雌性SD大鼠雙側股骨、脛骨,DMEM-F12培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔,沖洗液混勻,梯度密度離心棄上清后提取

6、沉淀,加入含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中,置37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所得第三代貼壁細胞經流式細胞儀檢測其分子表型。結果:成功的分離出形態(tài)為梭形的骨髓間充質干細胞,其分子表型為:CD31、CD45陰性、CD29、CD44、陽性。
　　2.大鼠膀胱平滑肌細胞(BSMCs)的分離與培養(yǎng)無菌操作條件下取3周齡雌性SD大鼠膀胱,采用膠原酶消化法分離膀胱平滑肌細胞,用含10%FBS的HG-DMEM培養(yǎng),所得貼壁細胞,免疫熒光

7、法鑒定其標志蛋白的表達。結果:平滑肌標志基因a-SMA,Calponin和SM-MHC均表達陽性。
　　3.建立大鼠膀胱平滑肌微環(huán)境誘導BMSCs體外分化模型BMSCs和膀胱平滑肌細胞分別種在懸掛式細胞培養(yǎng)小室transwell多孔膜(1um)兩側,cellcultureinserts放入六孔板中作為實驗組,以未經過共培養(yǎng)的同代同批次BMSCs作為對照組。收集接觸共培養(yǎng)4日后的BMSCs,RT-PCR、WesternBlot、及免

8、疫熒光檢測實驗組與對照組成肌分化后平滑肌標志性蛋白。結果:RT-PCR、WesternBlot、及免疫熒光結果顯示實驗組較對照組的BMSCs中平滑肌標志性蛋白的表達量顯著增加,說明BMSCs在平滑肌微環(huán)境中成肌分化,建模成功。
　　二、組蛋白乙?；瘜MSCs向BSMCs分化的影響
　　1.微球菌核酸酶實驗檢測BMSCs分化前后平滑肌標志性基因啟動子區(qū)染色質開放性,將第三代BSMCs接種于培養(yǎng)小室transwell下室面,放

9、入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后將翻轉過的transwell放入含平滑肌培養(yǎng)液的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。次日將BMSCs接種于膜內面。分別收集共培養(yǎng)3天的實驗組與對照組BMSCs,PCR檢測進行不同時間微球菌核酸酶處理的實驗組與對照組中三個標志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC啟動子區(qū)染色質開放性。對PCR產物運用凝膠分析軟件對DNA的量進行定量分析。結果:隨著時間的遞增,分化后的BMSCs啟動子區(qū)的PCR擴增效率明顯低于未分化的BMSCs

10、,說明與BMSCs接觸共培養(yǎng)能顯著的增強BMSCs平滑肌相關蛋白啟動子區(qū)域對核酸酶的敏感性,使啟動子開放性增強,開啟上游抗性基因和下游報告基因的表達,增加外源基因的轉化效率和轉化頻率。
　　2.ChIP檢測α-SMA、SM-MHC以及Calponin啟動子區(qū)H4表觀遺傳修飾狀態(tài),Transwell上室面取培養(yǎng)組和對照組中BMSCs,用甲醛固定活細胞,超聲將DNA打斷成不同大小的片段,用目的蛋白質H4特異性抗體免疫沉淀該蛋白質-DN

11、A復合物,復合物65℃解交聯(lián),分離純化DNA,后進行定量PCR擴增,擴增條件為98℃30s,變性94℃20s,退火60℃1min,延伸60℃1min,共40個循環(huán);Q-PCR檢測BMSCs分化前后平滑肌標志性基因啟動子區(qū)乙酰化差異。結果:經共培養(yǎng)誘導分化后,α-SMA、SM-MHC和Calponin啟動子區(qū)乙?；潭容^未分化前顯著增加,平滑肌標志基因啟動子區(qū)DNA的乙?；赡軈⑴c了BMSCs向SMCs分化過程。
　　結論:本研究成