小麥非生物脅迫相關(guān)LEA蛋白WZY1-2與WRAB18的功能研究.pdf

1、在植物的整個(gè)生命過程中，常會遭遇干旱、高鹽、高溫、冷害以及病蟲害等逆境脅迫，影響其正常生長。逆境可造成植物細(xì)胞不同程度的損傷，嚴(yán)重時(shí)將直接導(dǎo)致植株的死亡。逆境對植物的傷害主要表現(xiàn)在細(xì)胞脫水、膜系統(tǒng)遭到破壞、酶活性受影響以及胞內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂等。植物在長期進(jìn)化過程中也形成了各種防御機(jī)制來抵制這些不利因素對其自身的影響。胚胎發(fā)育晚期豐富表達(dá)蛋白（LEA蛋白），作為一類逆境相關(guān)蛋白，在植物逆境生理調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。為探索該家族蛋白在植物

2、逆境脅迫中發(fā)揮的功能，本論文以LEA蛋白第二家族成員WZY1-2蛋白和第三家族成員WRAB18蛋白為研究對象，對二者在植物逆境脅迫下的功能進(jìn)行了探討。
　　WZY1-2蛋白，為LEAⅡ家族蛋白（又稱脫水素、脫水蛋白）成員之一，具有該家族典型的保守序列:K片段和S片段，屬于SK3型脫水素，可受多種逆境信號分子誘導(dǎo)表達(dá)。本研究對脫水蛋白WZY1-2及其K、S片段分別缺失的衍生蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的定位和存在形式進(jìn)行了探討，確定了WZY1-

3、2蛋白在細(xì)胞中的定位及存在形式，并揭示了K片段或S片段的缺失對WZY1-2蛋白的亞細(xì)胞定位以及存在形式的影響;通過在大腸桿菌和本氏煙草細(xì)胞中對WZY1-2蛋白進(jìn)行過表達(dá)，研究其在干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫條件下對原核和真核生物抗逆性的影響。此外，本研究還通過蛋白與核酸互作的免疫共沉淀技術(shù)對脫水蛋白WZY1-2在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探究。研究結(jié)果如下:
　　1.本研究從鄭引1＃小麥中克隆獲得wzy1-2基因ORF序列并在大腸桿

4、菌中進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE中蛋白大小為理論分子量大小的二倍，通過雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)WZY1-2蛋白以同源二聚體的形式存在于植物細(xì)胞。以wzy1-2基因ORF序列為模板，利用重疊延伸PCR技術(shù)對wzy1-2基因K、S片段分別進(jìn)行缺失，獲得wzy1-2基因衍生物wzy1-2△K和wzy1-2△S，對二者分別進(jìn)行二聚化驗(yàn)證，結(jié)果顯示，分別缺失了K、S片段的衍生蛋白WZY1-2△K和WZY1-2△S在煙草葉片細(xì)胞內(nèi)依然

5、以二聚體的形式存在，該現(xiàn)象表明K、S片段并不影響脫水蛋白WZY1-2的同源二聚化。
　　2.分別構(gòu)建WZY1-2、WZY1-2△K以及WZY1-2△S蛋白與GFP融合的表達(dá)載體，通過在煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，WZY1-2與WZY1-2△K蛋白定位于細(xì)胞核中。部分WZY1-2△S蛋白在細(xì)胞核中定位，但也有部分WZY1-2△S蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜和胞質(zhì)中，由此可見，K片段對WZY1-2蛋白的核定位并無影響，而S

6、片段能夠影響WZY1-2的蛋白定位，但并不是決定因素。
　　3.將WZY1-2蛋白過表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)菌株與作為對照的轉(zhuǎn)pET28a空載菌株同時(shí)進(jìn)行干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫，通過對比菌株生長狀況，證明WZY1-2蛋白能夠在逆境條件下提高大腸桿菌的生存能力;構(gòu)建wzy1-2轉(zhuǎn)基因載體，利用農(nóng)桿菌葉盤浸染，通過組織培養(yǎng)獲得wzy1-2轉(zhuǎn)基因煙草，以野生型煙草為對照，通過對煙草生長表型、根長、發(fā)芽率、種子活力以及氧化脅迫

7、相應(yīng)生理指標(biāo)進(jìn)行分析，表明脫水蛋白WZY1-2可在多種非生物脅迫下增強(qiáng)煙草的抗逆性。
　　4.利用Ni2+柱對原核表達(dá)獲得的WZY1-2蛋白進(jìn)行純化，并制備特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，將WZY1-2蛋白與低溫脅迫36 h后小麥葉片基因組DNA共同孵育，對瓊脂糖珠所捕獲復(fù)合物分別進(jìn)行核酸和蛋白電泳檢測，結(jié)果顯示，脫水蛋白WZY1-2能夠與核酸結(jié)合。
　　WRAB18蛋白，屬于LEAⅢ蛋白家族，具有LEAⅢ家族保守氨基酸序列(

8、TAQAAKEKAGE)。本研究確定了WRAB18蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的定位及其在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下，對乳酸脫氫酶(LDH)活性的保護(hù)作用。將WRAB18蛋白在大腸桿菌和煙草中進(jìn)行過表達(dá)，探索其在干旱、高鹽、高溫和低溫四種非生物脅迫條件下對原核和真核生物的作用。同時(shí)，本研究克隆獲得了WRA B18基因全長及其上游啟動(dòng)子序列，并對啟動(dòng)子序列所包含的順式作用元件進(jìn)行分析。研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建WRAB18蛋白C端GFP融合

9、表達(dá)載體WRAB18-pA7GFP，通過農(nóng)桿菌菌液注射使GFP∷WRAB18融合蛋白在煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)。在GFP激光通道和mCherry通道下，利用激光共聚焦顯微鏡對煙草葉片細(xì)胞原生質(zhì)體中GFP∷WRAB18融合蛋白和質(zhì)體定位蛋白Marker(pt-rk CD3-999)進(jìn)行共定位觀察，結(jié)果顯示，WRAB18蛋白定位于煙草葉片細(xì)胞質(zhì)體中。
　　2.將純化的WRAB18蛋白與乳酸脫氫酶(LDH)溶液分別在干燥、高鹽、高溫和低溫條件下

10、共同孵育，酶活性分析表明，逆境條件下，含WRAB18蛋白的反應(yīng)體系中LDH的酶活性明顯高于不含WRAB18蛋白的對照組。
　　3.將WRAB18蛋白分別在大腸桿菌BL21(DE3)和煙草中進(jìn)行過表達(dá)，對大腸桿菌菌株以及轉(zhuǎn)基因煙草分別進(jìn)行干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫，與對照組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示W(wǎng)RAB18蛋白的過表達(dá)可在多種逆境脅迫下提高原核和真核細(xì)胞的抗逆性。
　　4.以小麥葉片基因組DNA為模板，克隆獲得WRAB18基因的全

11、長序列610bp，其中包含1個(gè)100 bp的內(nèi)含子區(qū)域和2個(gè)分別為60bp、450 bp的外顯子區(qū)域?？寺～@得WRAB18基因上游2000 bp序列，經(jīng)Plant CARE Database分析顯示，該序列包含TATA-box和CAAT-box等啟動(dòng)子保守元件，并含有逆境脅迫相關(guān)順式作用元件: ABREs、GARE、LTREs、MBS等。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對干旱、高鹽、高溫和低溫四種非生物脅迫后小麥幼苗葉片中WRAB18基因表達(dá)