NF-κBp65，I-κBα及iNOS在豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血再灌注耳蝸損傷中的作用和葛根素的保護(hù)作用研究.pdf

1、第一部分椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注對(duì)豚鼠聽功能和耳蝸形態(tài)學(xué)影響。 目的:建立豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注耳蝸損傷模型，探討椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注耳蝸損傷后耳蝸病理形態(tài)學(xué)和聽功能改變。 方法:經(jīng)顱底徑路建立豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注耳蝸損傷模型。顯露基底動(dòng)脈，用無創(chuàng)傷微動(dòng)脈夾阻斷基底動(dòng)脈，缺血1小時(shí)后松開微動(dòng)脈夾恢復(fù)血流行再灌注。68只豚鼠隨機(jī)分成6組：正常組、缺血1小時(shí)組、缺血再灌注組(按再灌注時(shí)間分12h、24h、48h、7

2、d四組)。各組動(dòng)物分別于手術(shù)前和處死前行聽性腦干反應(yīng)(auditorybrainstem response,ABR)測定，觀察ABR各波潛伏期、Ⅰ-Ⅲ波間期和Ⅲ波閾值，部分動(dòng)物觀察了缺血時(shí)ABR變化。應(yīng)用耳蝸基底膜鋪片和耳蝸組織切片HE染色技術(shù)觀察組織細(xì)胞形態(tài)變化。 結(jié)果: 1.聽功能檢測：血管阻斷缺血時(shí)ABR表現(xiàn)波形不典型，重復(fù)性差，在缺血10～20min后波形逐漸穩(wěn)定；缺血組與再灌注(12h、24h、48h、7d)各

3、組ABR各波潛伏期和Ⅰ-Ⅲ波間期較正常組延長，Ⅲ波閾值升高，尤以再灌注24h變化最為顯著，48h和7d后ABR閾值有所恢復(fù)，但不能恢復(fù)正常。 2.耳蝸病理形態(tài)學(xué)改變：缺血組毛細(xì)胞變形腫脹，再灌注(12h、24h、48h、7d)各組損傷進(jìn)一步加重，再灌注24～48小時(shí)損傷最重，可見明顯外毛細(xì)胞缺損，螺旋神經(jīng)元胞體和神經(jīng)纖維較正常組減少，血管紋變薄，均以基底轉(zhuǎn)為明顯。 結(jié)論:豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注時(shí)可致耳蝸損傷，表現(xiàn)為聽

4、功能和耳蝸組織形態(tài)學(xué)改變。 第二部分 NF-κBp65、Ⅰ-κBα及iNOS在豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注耳蝸損傷中的作用。 目的:探討豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注時(shí)NF-κB p65/I-κBa-iNOS通路在耳蝸再灌注損傷中的分子作用機(jī)制。了解 NF-κBp65、IκBα、iNOS 蛋白質(zhì)在耳蝸缺血再灌注損傷過程中的空間分布特點(diǎn)和表達(dá)時(shí)間規(guī)律；確定是否存在NF-κBp65的激活和核轉(zhuǎn)位及有無IκBα的降解，為耳蝸缺血再灌

5、注損傷的藥物防治提供理論依據(jù)。 方法:采用石蠟包埋的免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)各組近中軸位切片行 NF-κBp65(nuclear factor kappa Bp65)、IκBa(inhibitory kappa B)、iNOS(inducible nitric oxide synthase)免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察耳蝸組織內(nèi)的表達(dá)情況，并通過圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量處理分析；提取缺血再灌注側(cè)耳蝸組織的細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，采用

6、western blot技術(shù)分別研究了正常組、缺血再灌注12h、24h、48h組細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)NF-κBp65蛋白水平以及細(xì)胞漿內(nèi)hd3α蛋白水平；應(yīng)用電泳遷移率滯后分析(Electrophoretic mobility shiR assay,EMSA)檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB DNA 結(jié)合活性；電泳結(jié)果成像并行電泳條帶光密度測定進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: 1.正常組豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti’s器、血管紋、螺旋韌

7、帶的細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65染色呈陰性，缺血組耳蝸各轉(zhuǎn)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti’s器內(nèi)、外毛細(xì)胞、血管紋、螺旋韌帶有弱陽性表達(dá)，以血管紋、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)表達(dá)較強(qiáng)，主要見細(xì)胞漿著色。缺血再灌注各組在上述部位表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在再灌注12h可見明顯表達(dá)，24h表達(dá)最強(qiáng)，以后表達(dá)逐漸減弱，尤在底轉(zhuǎn)表達(dá)明顯，著色部位主要在胞核，尤其是在再灌注24h胞核著色最為明顯。正常組與缺血組及缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.0

8、1)。缺血組與缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 2.對(duì)照組耳蝸螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋和Corti’s器的細(xì)胞漿內(nèi)可見IκBα陽性表達(dá)。著色部位主要在胞漿。缺血再灌注后各組上述部位表達(dá)減弱。在再灌注12h表達(dá)可見較明顯減弱，再灌注24h最弱，48h及7天的表達(dá)有所增強(qiáng)。在再灌注48h及7天組可見胞核內(nèi)亦有表達(dá)。正常組與缺血組及缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。缺血組與缺血再灌注各組比

9、較灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 3.正常組iNOS在耳蝸各轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋、Corti器內(nèi)外毛細(xì)胞未見明顯陽性表達(dá)，缺血組和再灌注各組的iNOS表達(dá)逐漸增強(qiáng)，再灌注24h組表達(dá)最強(qiáng)。著色部位為細(xì)胞漿。正常組與缺血組及缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。缺血組與缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 4.Western Blot檢測結(jié)果顯示：在正常對(duì)照組，NF-κBp65亞基主

10、要存在于胞漿內(nèi)，胞核表達(dá)低；在缺血再灌注組耳蝸組織胞漿內(nèi)NF-κBp65蛋白明顯下降，而胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白則明顯上調(diào)。再灌注12h耳蝸組織胞漿內(nèi)NF-κBp65蛋白開始下降，24h達(dá)最低，48h后又有所上升，而胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白的變化則與此相反。在缺血再灌注模型組的耳蝸組織胞漿IkBα水平下降，24h降至最低，48h時(shí)IkBα水平有所上升。 5.正常對(duì)照組耳蝸組織中可見少量的NF-κB活化；在缺血再灌注組的耳蝸組

11、織中NF-κBDNA的結(jié)合活性顯著上調(diào)。再灌注24h的結(jié)合活性最高。再灌注48h后NF-κBDNA的結(jié)合活性下降，但仍然高于正常組。正常對(duì)照組與缺血再灌注各組比較積分光密度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 結(jié)論: 1、耳蝸缺血再灌注損傷時(shí)，NF-κB和iNOS在耳蝸出現(xiàn)異常表達(dá)，IkBα表達(dá)下調(diào)，NF-κB的活化、IkBα的降解和iNOS表達(dá)增強(qiáng)在耳蝸缺血再灌注損傷中可能起了一定作用。 2、利用western b

12、lot檢測細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平和細(xì)胞漿內(nèi)IkBα蛋白水平，證實(shí)耳蝸缺血再灌注損傷時(shí)NF-κB激活時(shí)存在NF-κBp65亞基的核轉(zhuǎn)位及IkBα的降解。 3、電泳遷移率滯后分析(EMSA)證實(shí)在耳蝸缺血再灌注損傷過程中NF-κBDNA結(jié)合活性增高。 第三部分葛根素對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷時(shí)聽功能和NF-κBp65、，I-κBα、iNOS的影響。 目的：探討葛根素在豚鼠椎基底動(dòng)脈缺血/再灌注耳蝸損傷中的保護(hù)作

13、用及分子機(jī)制，為葛根素治療耳蝸缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。 方法:純白雄性豚鼠32只隨機(jī)分為4組，每組8只：正常對(duì)照組、缺血再灌注7d組、生理鹽水組，即缺血再灌注7d加生理鹽水對(duì)照組和用藥組，即缺血再灌注7d加葛根素保護(hù)組。除正常對(duì)照組外的所有豚鼠均進(jìn)行手術(shù)造模。用藥組在缺血再灌注開始時(shí)，腹腔注射葛根素150mg/kg/d，每日一次，連用6天，于再灌注7天時(shí)處死。生理鹽水組操作同用藥組，但以等容量生理鹽水代替葛根素。應(yīng)用聽性腦干

14、反應(yīng)和耳蝸組織切片HE染色法分別評(píng)價(jià)聽功能和組織病理學(xué)的變化。采用石蠟包埋的免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)各組近中軸位切片行NF-κBp65、IκBα、iNOS免疫組織化學(xué)染色，以觀察葛根素對(duì)NF-κBp65、IκBα、iNOS的影響。 結(jié)果:用藥組ABR各波潛伏期和Ⅰ～Ⅲ波間期明顯縮短，閾值降低。正常對(duì)照組、缺血再灌注7 d組、用藥組與生理鹽水對(duì)照組ABR各波潛伏期、Ⅰ～Ⅲ波間期和閾值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。正常對(duì)照組與用藥組