酮洛芬前體藥物經(jīng)皮吸收的選擇性及代謝機(jī)理研究.pdf

1、該課題以臨床常用的非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥酮洛芬為模型藥物，合成一系列酯類前體藥物，從離體活性皮膚、皮膚細(xì)胞及在體皮膚三方面進(jìn)行經(jīng)皮吸收過程中皮膚生物轉(zhuǎn)化的深入研究，并從mRNA水平揭示皮膚羧酸酯酶代謝的分子機(jī)理.通過該課題的研究，可為手性藥物開發(fā)和前體藥物透皮吸收制劑的研制提供理論指導(dǎo)和技術(shù)借鑒.該文建立酮洛芬、酮洛芬甲酯、酮洛芬乙酯、酮洛芬異丙酯的反相高效液相色譜測定方法，具有前體藥物和代謝物不經(jīng)分離直接測定、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好、方法回收率和

2、精密度都符合體內(nèi)外經(jīng)皮滲透和代謝實(shí)驗(yàn)測定需要等特點(diǎn).采用AGP手性柱建立酮洛芬對(duì)映體的反相高效液相色譜拆分、測定方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，皮膚蛋白等雜質(zhì)不干擾測定，方法回收率和精密度達(dá)到體外經(jīng)皮滲透和代謝實(shí)驗(yàn)的分析要求.采用離體活性皮膚的表皮勻漿進(jìn)行水浴溫孵實(shí)驗(yàn)，考察酮洛芬前體藥物的皮膚代謝特征.人體表皮與不同種類動(dòng)物表皮的酯酶代謝能力相差顯著（P＜0.05），按蛋白含量校正它們的代謝能力依次為SD大鼠表皮＞長大二元雜交幼豬表皮＞成人包皮

3、的表皮＞新西蘭家兔表皮＞嬰兒表皮.人體表皮代謝產(chǎn)物中以R-酮洛芬為主，幼豬和家兔表皮代謝產(chǎn)物中也以R-酮洛芬占優(yōu)勢，但SD大鼠表皮勻漿代謝產(chǎn)物中酮洛芬對(duì)映體的濃度未見差異（P＞0.05），說明不同種類動(dòng)物表皮與人體表皮酯酶代謝的能力及選擇性不同.采用外科手術(shù)和酶消化等方法體外分離皮膚，以水平式（兩室）擴(kuò)散池進(jìn)行酮洛芬和前體藥物透過全皮、除角質(zhì)層皮膚和真皮的離體滲透代謝實(shí)驗(yàn).在經(jīng)離體裸小鼠全皮和真皮的滲透代謝實(shí)驗(yàn)中，酮洛芬前體藥物經(jīng)全皮滲

4、透代謝的穩(wěn)態(tài)速率顯著大于經(jīng)真皮滲透代謝的穩(wěn)態(tài)速率（P＜0.05），酮洛芬前體藥物經(jīng)皮滲透代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)束后皮膚中的殘留總量顯著大于酮洛芬經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)束后皮膚中的殘留量（P＜0.05），說明裸小鼠的表皮是酯酶代謝的主要部位，而酮洛芬前體藥物有助于增加皮膚局部的藥物積累.在經(jīng)離體猴全皮、除角質(zhì)層皮膚及真皮的滲透代謝實(shí)驗(yàn)中，酮洛芬前體藥物經(jīng)全皮滲透代謝的穩(wěn)態(tài)速率小于除角質(zhì)層皮膚（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)結(jié)束后皮膚中殘留藥物的總量大于除角質(zhì)層皮膚（

5、P＜0.05），說明角質(zhì)層是經(jīng)皮吸收的屏障而不是皮膚代謝的部位，且能夠貯存很多藥物;酮洛芬前體藥物經(jīng)真皮滲透代謝的穩(wěn)態(tài)速率小于全皮和除角質(zhì)層皮膚（P＜0.05），但相對(duì)較厚的猴真皮也具有相當(dāng)大的酯酶代謝能力.采用RT-PCR方法，以人肝L02細(xì)胞株為陽性對(duì)照，首次研究皮膚羧酸酯酶的表達(dá)特征.PCR產(chǎn)物包括全部的表達(dá)羧酸酯酶活性位點(diǎn)的序列，說明該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物正確、RT-PCR方法可靠，這為進(jìn)一步研究人體其它器官或組織中羧酸酯酶的表達(dá)提供了

6、良好借鑒.皮膚組織、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞系中都有人肝羧酸酯酶-2的強(qiáng)表達(dá)，而人肝羧酸酯酶-1在它們中的表達(dá)未被檢測到，說明人肝羧酸酯酶-2對(duì)酮洛芬前體藥物的水解有選擇性，這為廣大經(jīng)皮吸收研究人員合成和篩選前體藥物以改善藥物經(jīng)皮吸收特性的研究提供了理論依據(jù).在以后的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步利用分子生物學(xué)的有關(guān)技術(shù)識(shí)別皮膚組織中的藥物代謝酶，并在體外表達(dá)重組蛋白質(zhì)后鑒定其藥理作用，這種方法為深入研究各種皮膚代謝酶的結(jié)構(gòu)