除草劑咪唑乙煙酸對(duì)玉米根系的對(duì)映體選擇性抑制及機(jī)理研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)有機(jī)化合物廣泛存在于環(huán)境中，其手性對(duì)映異構(gòu)體在生物有效性、環(huán)境安全性等方面存在不可忽視的差異性，已越來(lái)越引起人們的重視。作為我國(guó)除草劑支柱產(chǎn)品的咪唑啉酮類(lèi)除草劑是典型的具有手性結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，其對(duì)映體對(duì)靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶(ALS)的離體活性表現(xiàn)出對(duì)映體選擇性抑制。然而，酶活抑制的手性差異性機(jī)理尚未被揭示，對(duì)映體對(duì)植株的差異性抑制研究也尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴建立了最具代表性的咪唑啉酮除草劑咪唑乙煙酸(IM)對(duì)

2、映體在高效液相色譜(HPLC)上的手性分離條件。在得到對(duì)映體制備樣的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)咪唑乙煙酸的對(duì)映異構(gòu)體以及外消旋體作用于玉米幼苗和擬南芥幼苗的研究，一方面觀察作為土施農(nóng)藥，其對(duì)首要作用部位根系的生長(zhǎng)形態(tài)、亞顯微結(jié)構(gòu)和根毛發(fā)生發(fā)育的選擇性影響，以及植物體內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)與根毛的形成、發(fā)育之間的相互關(guān)系；另一方面，研究其對(duì)靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶活性抑制的對(duì)映體選擇性差異及機(jī)理。從這兩方面探明和揭示IM對(duì)映體對(duì)植物的對(duì)映體選擇性抑制及機(jī)理

3、。本文取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑵在高效液相色譜上，采用Chiralpak OJ手性柱，以正己烷/乙醇/乙酸(75/25/0.5，v/v/v)為流動(dòng)相，基線分離得到IM的對(duì)映體。并采用HPLC-CD聯(lián)用技術(shù)，確定對(duì)映體的出峰次序和CD光譜圖。通過(guò)八區(qū)律確定了IM兩個(gè)對(duì)映體的絕對(duì)構(gòu)型分別為S-(+)-IM和R-(-)-IM。同時(shí)以所建立的對(duì)映體分離方法制備了對(duì)映體標(biāo)樣。
　　 ⑶通過(guò)除草劑IM對(duì)映體(濃度為100，2

4、00，400和800μg L-1)作用于玉米和擬南芥幼苗的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IM顯著抑制植株地上部和根系的生長(zhǎng)，使植株表現(xiàn)出明顯的毒害癥狀，包括葉子萎黃、生長(zhǎng)停滯以及根尖潰爛等。IM對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用呈對(duì)映體選擇性，R-(-)-IM的毒害作用最強(qiáng)，S-(+)-IM的生長(zhǎng)抑制作用最弱，外消旋的抑制能力介于左右旋之間。
　　 ⑷當(dāng)處理濃度為100，200，400和800μg L-1，IM對(duì)玉米根系形態(tài)呈對(duì)映體選擇性影響，根直徑增粗，而根表面積

5、和體積顯著減小，側(cè)根數(shù)也顯著減少，根系活力顯著下降。200和400μg L-1IM對(duì)映體分別選擇性抑制玉米和擬南芥根毛的生長(zhǎng)，根毛長(zhǎng)度明顯變短，數(shù)量顯著減少，根毛細(xì)胞破損。通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥DR5∷GFP觀察根部的生長(zhǎng)素水平發(fā)現(xiàn)，IM處理降低了生長(zhǎng)素含量，在受抑制強(qiáng)烈的R-(-)-IM中，根毛中熒光強(qiáng)度比S-(+)-IM處理的弱，表明生長(zhǎng)素含量低。添加外源生長(zhǎng)素處理，可緩解根毛生長(zhǎng)的抑制狀況。根中生長(zhǎng)素含量的降低是IM毒害根毛生長(zhǎng)的重要原

6、因。400μg L-1IM處理對(duì)根冠細(xì)胞器亞顯微結(jié)構(gòu)具有對(duì)映體選擇性毒害作用，導(dǎo)致根尖細(xì)胞核呈不規(guī)則形狀，而且核仁消失，其他細(xì)胞器數(shù)量減少，個(gè)體變小。其中，線粒體膜解體，線粒體嵴也變得模糊不清；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜斷裂；高爾基體膜囊腫脹，小液泡消失。IM處理還導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞壁增粗，纖維化，失去彈性，其中平衡石的亞顯微結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致根系橫向生長(zhǎng)。
　　 ⑸施入土壤或殘留的除草劑對(duì)植株的對(duì)映體選擇性毒害首先表現(xiàn)在對(duì)根系的快速抑制，其通過(guò)對(duì)根系

7、形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變、對(duì)根細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞、對(duì)根系和根毛生長(zhǎng)的抑制以及生理活性抑制，最終導(dǎo)致對(duì)植株的毒害。IM對(duì)離體和活體ALs酶活性均存在對(duì)映體選擇性抑制，R-(-)-對(duì)映體的抑制作用最強(qiáng)，S-(+)-對(duì)映體的抑制作用最弱，(±)-IM介于左右旋之間。離體酶活性抑制情況比較復(fù)雜，隨著處理濃度變化，左右旋抑制差異呈規(guī)律性變化，當(dāng)IM濃度為40μg L-1時(shí)，R-(-)-對(duì)映體對(duì)離體酶活的抑制率達(dá)到5.6％，而S-(+)-對(duì)映體對(duì)酶活僅有微弱

8、的抑制，抑制率為0.2％，右旋和左旋抑制能力相差25倍之多。隨著濃度的升高，抑制作用越加顯著，左右旋的差異也逐漸減少。濃度升高至200μg L-1，R-(-)-IM的抑制率為28.9％，S-(+)-和(±)-IM為3.8％和19.8％。R-(-)-對(duì)映體和S-(+)-對(duì)映體的抑制率差異降低至7倍。當(dāng)IM濃度低于1 mg L-1，S-(+)-IM的抑制作用上升緩慢，而R-(-)-IM的抑制卻已很強(qiáng)烈，1 mg L-1時(shí)已經(jīng)達(dá)到70.4％。

9、隨著的濃度呈倍數(shù)升高，S-(+)-對(duì)映體的抑制作用也顯著提高，在5mg L-1和25 mg L-1，S-(+)-，R-(-)-和(±)-IM三者都對(duì)酶活有很高的抑制，左右旋的差異僅為1倍多。；100，200，400和800μg L-1的IM處理后，左右旋對(duì)活體酶活抑制的差異在2倍左右，與植株生長(zhǎng)抑制情況一致。表明活體酶活與生長(zhǎng)情況有更大的相關(guān)性。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明IM對(duì)映體與ALS相互作用存在立體選擇性，R-(-)-IM才是與ALS結(jié)合的

10、優(yōu)勢(shì)構(gòu)型。因此R-(-)-IM比S-(+)-IM對(duì)ALS的抑制作用更強(qiáng)。
　　 ⑹農(nóng)藥的手性研究、單一光學(xué)活性異構(gòu)體生產(chǎn)上的突破，是減少生態(tài)環(huán)境污染和推行綠色農(nóng)業(yè)的必然要求。為此，在手性層面上深入研究對(duì)映異構(gòu)體的活性、作用機(jī)理等問(wèn)題具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本文通過(guò)對(duì)咪唑乙煙酸的對(duì)映體以及外消旋體作用于玉米和擬南芥幼苗根系及靶標(biāo)酶的研究，探明和揭示IM對(duì)映體對(duì)植物的對(duì)映體選擇性抑制及機(jī)理，為客觀評(píng)價(jià)咪唑啉酮類(lèi)除草劑的生物活性、生產(chǎn)上如何