CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及纖維腺瘤組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、背景與目的:乳腺癌是來(lái)自乳腺導(dǎo)管或終末導(dǎo)管小葉單元上皮的惡性腫瘤。發(fā)病率在過(guò)去的50年中呈現(xiàn)出了緩慢上升的趨勢(shì),已經(jīng)超過(guò)子宮頸癌的發(fā)病率躍居女性惡性腫瘤的第一位。近10年來(lái),我國(guó)乳腺癌發(fā)病率增加了47％。與歐美國(guó)家相比較,我國(guó)乳腺癌病人的年齡呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)。相關(guān)的調(diào)查顯示,我國(guó)每年約有4萬(wàn)人死于乳腺癌,已經(jīng)成為城市女性的“第一殺手”。目前,乳腺癌的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明,研究顯示其發(fā)病與雌激素的長(zhǎng)期作用、家族遺傳傾向、環(huán)境因素及長(zhǎng)時(shí)間大

2、劑量接觸放射線等因素有關(guān)。
　　 乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與其他惡性腫瘤相似,也是一個(gè)多步驟多階段的復(fù)雜過(guò)程。惡性腫瘤的一個(gè)重要特性就是侵襲和轉(zhuǎn)移,其過(guò)程同樣也是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟。已有許多研究表明,細(xì)胞外基質(zhì)的降解和基底膜的重塑是癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),此過(guò)程需要借助蛋白降解酶的表達(dá)和激活。目前已知的蛋白降解酶類有半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋

3、白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal poroteinases,MMPs)。MMPs是一組重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶,在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中此酶通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中不同成分的降解來(lái)發(fā)揮其重要作用。MMP-9是MMPs家族中的重要成員,它能降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,如Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白,研究認(rèn)為此過(guò)程與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 腫瘤的侵襲是一個(gè)多因素共同參與、多步驟完成的復(fù)雜過(guò)程:(1)腫瘤細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜

4、表面的受體粘附到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的層粘連蛋白上;(2)蛋白酶水解前體的釋放以及活化;(3)蛋白水解酶對(duì)ECM(主要是Ⅳ型膠原蛋白)的降解過(guò)程;(4)腫瘤細(xì)胞穿過(guò)基底膜的遷移過(guò)程。這其中,在形成ECM的兩大重要組成部分(基底膜和間質(zhì))中,基底膜構(gòu)成一道有效的阻滯屏障,這一屏障是以Ⅵ型膠原為主要成分,因而對(duì)其降解成為腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵步驟。大量研究證明,腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是與其誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋

5、白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力密切相關(guān)。在此過(guò)程中涉及兩大類酶系統(tǒng):一類是纖溶酶原系統(tǒng);另一類是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)系統(tǒng)。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是MMPs中最為重要的一種蛋白酶。組織金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases,TIMPs)是MMPs的天然抑制劑,TIMPs與MMPs的平衡對(duì)于維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。CD147作為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋

6、白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinaseinducer,EMMPRIN),它是一種新興的粘附分子,是一種免疫球蛋白超家族的糖蛋白,廣泛存在于人體的各個(gè)組織、器官。能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-間質(zhì)之間的粘附作用,同時(shí)參與機(jī)體的多種生理過(guò)程;并且CD147蛋白在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。最近研究報(bào)道108例膀胱癌患者中通過(guò)免疫組織化學(xué)方法研究了CD147蛋白的表達(dá)情況,研究的

7、結(jié)果表明CD147蛋白的表達(dá)與膀胱癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)以及預(yù)后呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性。另外通過(guò)多因素分析統(tǒng)計(jì)顯示CD147蛋白的過(guò)表達(dá)可以作為預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,由此CD147蛋白可以作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。有學(xué)者在鼠異種移植模型上證明CD147蛋白通過(guò)上調(diào)經(jīng)典的wnt/beta-連環(huán)蛋白信號(hào)路徑能夠?qū)е路伟┘?xì)胞侵襲、增殖以及轉(zhuǎn)移的發(fā)生。有學(xué)者通過(guò)免疫組織化學(xué)方法在48例喉癌患者和15例喉炎患者中分別檢測(cè)CD147

8、蛋白、MMP-9和MMP-2蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示了這三種蛋白的表達(dá)在喉癌患者中顯著增高,三種蛋白的高表達(dá)均與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究報(bào)道在兒童非霍奇金氏淋巴瘤中通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)了CD147蛋白和MMP-9蛋白的表達(dá)情況,研究結(jié)果顯示兩種蛋白的表達(dá)均與腫瘤臨床分期、腫瘤大小、骨髓轉(zhuǎn)移、免疫表型及預(yù)后不良相關(guān)。而且這兩種蛋白的高表達(dá)均與患者的預(yù)后不良相關(guān)。
　　 最近的研究已表明,成纖維細(xì)胞平時(shí)僅產(chǎn)生極少量的M

9、MPs,但在有腫瘤細(xì)胞存在時(shí)可刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的MMPs,已證實(shí)這種刺激因子就是存在于腫瘤細(xì)胞表面的一種粘附分子—細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147。CD147參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用,刺激鄰近的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9、MMP-2),并降解細(xì)胞外基質(zhì),為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。
　　 Annexins蛋白是一類鈣結(jié)合蛋白家族,其作用受鈣離子調(diào)節(jié),能夠參與一系列與鈣離子相關(guān)的生物學(xué)活動(dòng),并且能夠結(jié)

10、合到帶負(fù)電荷的膜磷脂上。由于鈣離子參與了人體廣泛的生物學(xué)活動(dòng),Annexins的生物學(xué)作用因此也備受關(guān)注。目前的研究發(fā)現(xiàn).AnnexinⅡ蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中具有多種功能,主要表現(xiàn)在:(1)在細(xì)胞內(nèi)AnnexinⅡ蛋白在生物膜結(jié)構(gòu)域的建立或穩(wěn)定、DNA合成及細(xì)胞增殖、胞膜運(yùn)輸、形成離子通道等方面起到了重要的作用;(2)在細(xì)胞外的AnnexinⅡ蛋白作為受體,同時(shí)還參與了細(xì)胞間的粘附、纖維蛋白酶的溶解、配體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及病毒感染

11、等方面的過(guò)程;(3)AnnexinⅡ蛋白的異常表達(dá)還參與了人類多種疾病的發(fā)生過(guò)程。并且它的表達(dá)異常和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。
　　 有關(guān)CD147、MMP-9和AnnexinⅡ在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá)研究在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道均不多見。本研究在人類乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織以及乳腺纖維腺瘤中應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白這三個(gè)指標(biāo)的表達(dá),以及這三種蛋白間相互關(guān)系。旨在進(jìn)一步明

12、確CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的作用以及意義,進(jìn)一步明確三種蛋白間的相互關(guān)系;為探討乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制,從而為更加有效地防治乳腺癌提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)材料
　　 60例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織及60例乳腺纖維腺瘤組織存檔蠟塊取自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科,為2008年1月至2010年1月手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊,患者均為

13、女性,年齡26-70歲,平均年齡為45.9歲。術(shù)前均未進(jìn)行化療、免疫及放射治療。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查后證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及乳腺纖維腺瘤。所有手術(shù)切除的標(biāo)本均經(jīng)4％中性甲醛固定后石蠟包埋,連續(xù)切片,進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。按2003年WHO提出的乳腺分級(jí)法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌H.E切片進(jìn)行評(píng)分和分級(jí)。
　　 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:(1)、腺腔形成:占腫瘤的大部分(＞75％)為1分,中等程度(10-75％)為2分,少和無(wú)

14、(＜10％)為3分;(2)、核多型性:小而規(guī)則一致的細(xì)胞為1分,中等大小及異型性為2分,明顯異型為3分;(3)、每10個(gè)高倍視野下核分裂像計(jì)數(shù):0-5個(gè)為1分,6-10為2分,＞11個(gè)為3分。以上3項(xiàng)得分相加,積分3-5分者為組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí),6-7分者為Ⅱ級(jí),8-9分者為Ⅲ級(jí)。
　　 2.試劑
　　 羊抗人CD147多克隆抗體(sc-25531)購(gòu)自Santa Cruz公司;MMP-9多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限

15、公司;AnnexinⅡ多克隆抗體(sc-9061)、S-P超敏試劑盒(SP-9001)和DAB酶底物顯色試劑盒(DABZLI-9032)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。
　　 3.方法
　　 免疫組織化學(xué)(S-P)方法檢測(cè)60例乳腺纖維腺瘤組織及60例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)
　　 1)步驟:采用鏈霉菌素-過(guò)氧化物酶法(streptavidin-peroxida

16、se,S-P)。PBS代替第一抗體作陰性對(duì)照結(jié)果陰性,用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果陽(yáng)性。
　　 2)判定標(biāo)準(zhǔn):
　　 以細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為AnnexinⅡ蛋白和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞;細(xì)胞胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為CD147陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果判定:采用雙盲法參照Fromowitz提出的染色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估:CD147陽(yáng)性表達(dá)為在腫瘤細(xì)胞胞膜上及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒;MMP-9陽(yáng)性表達(dá)在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。著色強(qiáng)度分

17、為:無(wú)色(-)為0分、淡黃色(+)為1分、黃色(++)為2分,黃褐色(+++)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分率為:≤30％為0分、31％-70％為1分、≥71％為3分。兩項(xiàng)得分相加所得的總分進(jìn)行結(jié)果評(píng)定:0分為陰性,(1～2)分為弱陽(yáng)性(+),(3～4)分為中度陽(yáng)性(++),(5～6)分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS for windows13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行X2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=

18、0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺纖維腺瘤組織中均呈現(xiàn)陰性表達(dá)或僅微弱陽(yáng)性表達(dá)。CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中呈現(xiàn)出較強(qiáng)的表達(dá)。三種蛋白的表達(dá)在乳腺纖維腺瘤組織與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽(yáng)性率明顯高于纖維腺瘤組織。
　　 2.CD147蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陽(yáng)

19、性表達(dá)率為91.67％(55/60)。CD147蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)與年齡(X2=0.024,df=1,P=0.876＞0.05)、家族史(X2=0.000,df=1,P=1.000＞0.05)、腫瘤大小(X2=1.185,df=2,P=0.553＞0.05)及臨床分期(X2=2.937,df=1,P=0.086＞0.05)均無(wú)關(guān),即不同年齡段、有無(wú)家族史、腫瘤大小及臨床分期不同的CD147蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

20、意義。但CD147蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)相關(guān),即不同組織學(xué)分級(jí)的CD147蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=8.601,P=0.006＜0.01),進(jìn)一步分別做組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)、Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)的CD147蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)CD147蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=4.773,P=0.029＞0.05/2=0.025)、Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)CD147蛋白的

21、陽(yáng)性表達(dá)率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018＜0.05/2=0.025),且組織學(xué)分級(jí)越低,CD147蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率就越高。另外,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的CD147蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.253,df=1,P=0.007＜0.01)。
　　 3.MMP-9蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為86.67％(52/60)。MMP-9蛋白在乳腺浸潤(rùn)導(dǎo)管癌組織中與年齡(X2=0.341,df

22、=1,P=0.559＞0.05)、家族史(X2=0.192,df=1,P=0.661＞0.05)、腫瘤大小、(X2=0.574,df=2,P=0.750＞0.05)及臨床分期(x2=1.737,dr=1,P=0.188＞0.05)均無(wú)關(guān),即不同年齡段、有無(wú)家族史、腫瘤大小及不同臨床分期的患者的MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但MMP-9蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)相關(guān),即不同組織學(xué)分級(jí)的MMP-9

23、蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=6.438,P=0.026＜0.05),進(jìn)一步分別做組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)、Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)的MMP-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)MMP-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=1.116,df=1,P=0.291＞0.05/2=0.025)、Ⅰ級(jí)與組織學(xué)Ⅲ級(jí)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018＜0.05/2=0.025),且組織學(xué)分級(jí)越低,MMP-9蛋白的陽(yáng)

24、性表達(dá)率越高。另外,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的MMP-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=8.679,df=1,P=0.003＜0.01)。
　　 4.AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為90.00％(54/60)。AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)與年齡(X2=0.365,df=1,P=0.546＞0.05)、家族史(X2=0.000,df=1,P=1.000＞0.05)、腫瘤

25、大小(X2=1.069,df=2,P=0.586＞0.05)及臨床分期(X2=1.350,df=1,P=0.245＞0.05)均無(wú)關(guān),即不同年齡段、有無(wú)家族史、腫瘤大小及臨床分期不同的AnnexinⅡ蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)相關(guān),即不同組織學(xué)分級(jí)的AnnexinⅡ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.356,P=0.017＜0.05),進(jìn)一步

26、分別做組織分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)、Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)的AnnexinⅡ蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:組織分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)的AnnexinⅡ蛋白表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=3.308,df=1,P=0.081＞0.05/2=0.025)、Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018＜0.05/2=0.025),且組織學(xué)分級(jí)越低,AnnexinⅡ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越高。另外有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的AnnexinⅡ蛋白表達(dá)陽(yáng)性率

27、不相同,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=5.192,df=1,P=0.023＜0.05)。
　　 5.CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)呈現(xiàn)出兩兩正相關(guān)性。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析顯示CD147與MMP-9兩種蛋白間具有顯著的相關(guān)性,r值為0.769,P值為0.000;CD147和AnnexinⅡ兩種蛋白間也具有顯著的相關(guān)性,r值為0.905,P值為0.000;另外MMP-9

28、和AnnexinⅡ兩種蛋白問(wèn)也具有顯著的相關(guān)性,r值為0.850,P值為0.000。
　　 結(jié)論：
　　 1.CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺纖維腺瘤組織中無(wú)表達(dá)或僅見微弱表達(dá);但在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中呈現(xiàn)出較強(qiáng)的表達(dá),提示其高表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生有關(guān)。
　　 2.CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的組織學(xué)分級(jí)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),提示其表達(dá)促進(jìn)了乳腺浸潤(rùn)性