旋毛蟲肌幼蟲谷氨酰胺依賴型抗酸機(jī)制的研究.pdf

1、旋毛蟲病是一種全球范圍內(nèi)流行的人獸共患寄生蟲病，宿主因食用生的或未熟的含有感染性包囊的肉類食品而感染，人感染嚴(yán)重時(shí)可致死亡。旋毛蟲在感染哺乳動(dòng)物的過程中，必須經(jīng)歷胃部的極酸性環(huán)境，旋毛蟲體內(nèi)可能具有像大腸桿菌一樣的抗酸機(jī)制來抵抗酸性環(huán)境對(duì)自身的損傷。近年來的研究表明，谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)是大腸桿菌體內(nèi)最重要的抗酸系統(tǒng)，在酸性培養(yǎng)基中(pH2.5)添加谷氨酰胺就可以維持細(xì)菌的抗酸性，谷氨酰胺抗酸系統(tǒng)在細(xì)菌體內(nèi)普遍發(fā)揮重要作用。已有研究證

2、明，在酸性條件下(pH2.5)培養(yǎng)旋毛蟲3h，旋毛蟲仍有較高的存活率，谷氨酰胺酶作為重要的抗酸物質(zhì)是否在旋毛蟲抗酸過程中發(fā)揮作用仍未可知，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此展開研究。
　　實(shí)驗(yàn)根據(jù)NCBI上已發(fā)表的旋毛蟲谷氨酰胺酶基因設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆旋毛蟲谷氨酰胺酶基因?？寺〉降钠闻cpMD-18T載體連接后轉(zhuǎn)化入克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)菌液測序后對(duì)克隆所得序列進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在序列中有稀有密碼子存在，因此實(shí)驗(yàn)選擇Rosetta(D

3、E3)菌株作為表達(dá)菌。將測序正確序列與表達(dá)載體pET-32a經(jīng)雙酶切處理后連接，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)感受態(tài)Rosetta(DE3)。表達(dá)菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、質(zhì)粒PCR和測序驗(yàn)證后開始誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，在37℃時(shí)0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h得到最大表達(dá)量。
　　表達(dá)所得蛋白經(jīng)切膠純化后與弗氏佐劑混合，皮下及四肢多點(diǎn)注射免疫家兔，制備谷氨酰胺酶抗體血清。運(yùn)用ELISA方法檢測免疫血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯

4、示抗體效價(jià)達(dá)到1.024×106。將血清作為一抗與旋毛蟲肌幼蟲全蛋白及純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測，均得到特異性條帶。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，純化后的重組谷氨酰胺酶蛋白具有良好的免疫原性與反應(yīng)原性。免疫熒光定位顯示，谷氨酰胺酶主要分布于旋毛蟲肌幼蟲表皮組織。
　　為研究酸性條件下旋毛蟲肌幼蟲谷氨酰胺酶表達(dá)量的變化，本實(shí)驗(yàn)將小鼠肌肉絞碎后挑取旋毛蟲在pH2.5、pH4.0、pH6.6和pH9.0條件下培養(yǎng)。在相同條件下培

5、養(yǎng)0.5h、1h、3h后，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測各組旋毛蟲谷氨酰胺酶mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示:除pH9.0組外，各組旋毛蟲谷氨酰胺酶mRNA相對(duì)表達(dá)量均有升高;各時(shí)間段旋毛蟲谷氨酰胺酶的mRNA表達(dá)量均隨著pH的降低而升高;pH2.5條件下，旋毛蟲谷氨酰胺酶mRNA表達(dá)量在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期均高于其他各組，差異極顯著(p＜0.01)。這表明酸性條件會(huì)顯著誘導(dǎo)旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)谷氨酰胺酶的表達(dá)。
　　哺

6、乳動(dòng)物胃液不僅是一個(gè)極酸性環(huán)境，且含有大量的胃蛋白酶。本研究為闡明胃蛋白酶是否對(duì)旋毛蟲谷氨酰胺酶表達(dá)量有影響，用pH2.5的人工胃液處理旋毛蟲3h后同樣進(jìn)行了熒光定量PCR檢測。將其與pH2.5生理鹽水3h組和pH6.6生理鹽水3h組對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，pH2.5人工胃液組與pH2.5生理鹽水組相比pH6.6生理鹽水組表達(dá)量明顯升高，都表現(xiàn)極顯著性差異(p＜0.01)，但pH2.5生理鹽水3h組和pH2.5人工胃液3h組之間相對(duì)表達(dá)量變化并

7、不明顯，差異不顯著(p＞0.05)。此外，對(duì)三組的旋毛蟲進(jìn)行免疫熒光分析，將獲得的熒光圖片用Image J選取有熒光的旋毛蟲區(qū)域分析光密度，并計(jì)算各組平均光密度。結(jié)果顯示:三組的平均光密度值分別為0.01679、0.01860和0.00630 pixel; pH2.5生理鹽水組和pH2.5人工胃液組熒光信號(hào)都明顯強(qiáng)于pH6.6生理鹽水組，且差異極顯著(p＜0.01)，而pH2.5生理鹽水組和pH2.5人工胃液兩組較為接近，差異不顯著(p