Adipophilin阻礙Nceh1對(duì)脂質(zhì)的水解促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積.pdf

1、目的:通過檢測adipophilin與Nceh1蛋白的結(jié)合情況；檢測adipophilin蛋白表達(dá)水平不同的RAW264.7細(xì)胞中，加入PMA共孵育前后，細(xì)胞內(nèi)Nceh1的表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的變化情況；觀察 adipophilin磷酸化后及脂滴出現(xiàn)后 Nceh1的轉(zhuǎn)位情況，探討adipophilin促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的機(jī)制。
　　方法:用免疫共沉淀方法檢測 adipophilin與Nceh1的結(jié)合情況；使用生物信息學(xué)方法分析 adip

2、ophilin與Nceh1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，觀察兩者結(jié)合的區(qū)域；在adipophilin表達(dá)水平不同的RAW264.7細(xì)胞中分別用半定量RT-PCR和Western印跡檢測Nceh1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化，用高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量的變化。用100nmol/L的PKC的激動(dòng)劑PMA預(yù)孵育穩(wěn)定高表達(dá)或沉默adipophilin基因的RAW264.7細(xì)胞40min后， Western印跡方法檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化adipophili

3、n的蛋白表達(dá)情況， Nceh1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化用半定量RT-PCR和Western印跡檢測，細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量變化采用高效液相色譜檢測。用50 mg/L ox-LDL孵育RAW264.7細(xì)胞24h后，用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)adipophilin與Nceh1的分布情況；超聲裂解PMA孵育前后的RAW264.7細(xì)胞提取adipophilin和磷酸化的adipophilin蛋白，Western印跡檢測磷酸化前后adipoph

4、ilin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布情況；超聲裂解ox-LDL孵育前后的RAW264.7細(xì)胞提取Nceh1蛋白，Western印跡檢測荷脂前后Nceh1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布情況。
　　結(jié)果:免疫共沉淀結(jié)果顯示 adipophilin與Nceh1能夠相互結(jié)合，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者是通過蛋白的疏水區(qū)殘基相互結(jié)合；adipophilin蛋白表達(dá)水平高的RAW264.7細(xì)胞中脂滴數(shù)量增加， adipophilin蛋白水平表達(dá)低的細(xì)胞中脂滴數(shù)量減少，

5、但是Nceh1的mRNA與蛋白表達(dá)沒有明顯變化；在高表達(dá)adipophilin的RAW264.7細(xì)胞中加入100nmol/L PMA共孵育后，磷酸化的adipophilin表達(dá)明顯增加，同時(shí)細(xì)胞中膽固醇酯的含量顯著下降，但是Nceh1的mRNA與蛋白表達(dá)沒有明顯變化。50 mg/L ox-LDL孵育RAW264.7細(xì)胞24h后，激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)adipophilin與Nceh1共同分布在脂滴表面；蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)在PMA孵育前的

6、RAW264.7細(xì)胞中adipophilin蛋白主要分布在脂滴表面，PMA孵育后細(xì)胞中磷酸化的adipophilin蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中；相反的，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)在未荷脂的細(xì)胞中Nceh1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在荷脂的細(xì)胞中Nceh1主要分布在脂滴上。
　　結(jié)論:Adipophilin與Nceh1通過氨基酸的疏水作用相互結(jié)合；Adipophilin磷酸化前后的表達(dá)變化并不能影響Nceh1的表達(dá)，adipophilin磷酸