卡介苗對哮喘大鼠氣道炎癥及重塑的影響.pdf

1、目的：探討卡介苗對哮喘大鼠氣道炎癥及重塑的預(yù)防作用及可能機(jī)制，以α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、白介素-4(IL-4)和γ-干擾素(IFN-γ)為指標(biāo)，用IFN-γ/IL-4間接反映Th1/Th2水平，反應(yīng)炎癥指標(biāo)，CyclinD1、α-SMA反映重塑指標(biāo)，觀察卡介苗是否可以調(diào)整Th1/Th2平衡，減輕氣道炎癥，延緩氣道重塑發(fā)生，從而改善哮喘癥狀，控制哮喘發(fā)展速度及可能機(jī)制。
　　 方法：

2、清潔級SD雄性大鼠40只，4周齡，體重50-100克之間，隨機(jī)分成正常對照組、哮喘模型組、多BCG接種組、BCG干預(yù)組每組10只。
　　 1、正常對照組(NS group)：所有的幼鼠于實(shí)驗(yàn)第1、8天對幼鼠腹腔注射生理鹽水2mL進(jìn)行致敏，第15天起將幼鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內(nèi)，予生理鹽水5mL霧化吸入30min，隔日1次，共激發(fā)20次，每次30min。
　　 2、哮喘模型組(asthma group)：所有的幼鼠于實(shí)

3、驗(yàn)第1、8天對幼鼠腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于9g/L生理鹽水2mL中）進(jìn)行致敏，第15天起將幼鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內(nèi)，予2％OVA生理鹽水5mL霧化吸入30min，隔日1次，共激發(fā)20次，每次30min，以出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸急促、活動(dòng)量下降典型的哮喘發(fā)作的癥狀為激發(fā)成功。
　　 3、多BCG接種組(multiple BCG vaccination group)：在OVA致敏前7、3、1天，每只幼鼠

4、分別皮內(nèi)注射BCG0.025mg，于實(shí)驗(yàn)第1、8天對幼鼠腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于9g/L生理鹽水2mL中）進(jìn)行致敏，第15天起將幼鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內(nèi)，予2％OVA生理鹽水5mL霧化吸入30min，隔日1次，共激發(fā)20次，每次30min，以出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸急促、活動(dòng)量下降典型的哮喘發(fā)作的癥狀為激發(fā)成功。
　　 4、BCG干預(yù)組(BCG intervention group)：所有的幼鼠于實(shí)驗(yàn)

5、第1、8天對幼鼠腹腔注射OVA100mg和氫氧化鋁100mg（混于9g/L生理鹽水2mL中）進(jìn)行致敏，于激發(fā)前7d(第8天)給予皮內(nèi)注射BCG0.025mg，第15天開始每日激發(fā)前30min給予皮內(nèi)注射BCG,劑量同上。
　　 最后一次激發(fā)24小時(shí)后，1％戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物、取材。動(dòng)物肺功能檢查（檢測氣道基本阻力和靜脈注射乙酰膽堿后氣道阻力變化）；肺組織行病理切片，HE染色，采用計(jì)算機(jī)圖象分析技術(shù)測定支氣管基底膜周徑(Pbm)，

6、總管壁面積(WAt)，平滑肌面積(WAm)等反映氣道壁厚度的指標(biāo)；ELISA法檢測各組大鼠血清中IFN-γ，IL-4含量的變化；免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠氣道壁CyclinD1、α-SMA的表達(dá)變化，并應(yīng)用圖像分析軟件測量CyclinD1、α-SMA的相對表達(dá)強(qiáng)度。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組大鼠肺功能的檢測：氣道激發(fā)試驗(yàn)檢測呼吸峰值的變化間接反應(yīng)氣道阻力（兩者成反比）結(jié)果顯示：鹽水激發(fā)(13.02±2.44，10.7

7、1±2.47，13.15±1.47，12.43±2.00，F(xiàn)=2.204，P＞0.1)和6.25μg/ml乙酰膽堿激發(fā)(11.62±0.80，11.16±0.91，11.38±1.03，10.63±1.19，F(xiàn)=1.453，P＞0.1)時(shí)各組間呼吸峰值的變化無明顯差異；隨著乙酰膽堿濃度的增加，哮喘模型組(8.79±1.31，6.47±1.62，4.55±1.03)呼吸峰值較正常組(12.36±1.35，12.36±1.59，11.80±

8、1.97)明顯減低；多BCG組(10.61±0.83，10.70±1.24，0.41±0.93)、干預(yù)組(10.47±1.77，9.50±1.04，9.65±1.20)呼吸峰值較正常對照組減低，但減低程度較哮喘模型組低。
　　 2、各組大鼠血清IL-4、IFN-γ的檢測：哮喘組(33.98±2.35)ng/L和多BCG組(16.46±1.92)ng/L、干預(yù)組(20.89±2.29)ng/L血清IL-4水平比正常組(11.43±

9、2.72)ng/L顯著升高，有顯著性差異；多BCG組和干預(yù)組IL-4水平較哮喘組明顯減低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且多BCG組與干預(yù)組之間有顯著性差異，多BCG組優(yōu)于干預(yù)組。哮喘組(10.9±1.9)ng/L和多BCG組(22.7±2.1)ng/L、干預(yù)組(18.5±1.5)ng/L血清IFN-γ水平比正常組(30.4±3.6)ng/L顯著減低，有顯著性差異；且各組之間均有顯著性差異，多BCG組優(yōu)于干預(yù)組。
　　 3、肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)

10、及分類與正常對照組(5.40±1.52)×106細(xì)胞總數(shù)的表達(dá)相比，哮喘模型組(17.15±3.02)×106、多BCG組(8.78±2.00)×106，干預(yù)組(11.87±2.31×106的數(shù)量明顯增加，有顯著性差異；多BCG組和干預(yù)組較哮喘組數(shù)量減低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且多BCG組明顯優(yōu)于干預(yù)組。與正常對照組(0.51±0.18)×106嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量相比，哮喘模型組(2.19±0.30)×106、多BCG組(1.19±0.31)

11、×106，干預(yù)組(1.49±0.30)×106的比例明顯增加，有顯著性差異；多BCG組和干預(yù)組較哮喘組表達(dá)減低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且多BCG組明顯優(yōu)于干預(yù)組。
　　 4、各組大鼠氣道重塑指標(biāo)的檢測：
　　 4.1各組大鼠氣道管壁厚度的檢測哮喘組大鼠肺組織可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌增加和平滑肌細(xì)胞增生，卡介苗干預(yù)后能明顯減少上述改變。分析比較各組大鼠氣道管壁面積、平滑肌面積結(jié)果顯示：哮喘模型組(98.17

12、±9.38、23.36±2.62)和多BCG(72.10±8.70、13.03±2.62)，干預(yù)組（80.34±9.23、18.61±2.31）氣道管壁面積、平滑肌面積顯著大于正常對照，多BCG組和干預(yù)組氣道管壁面積、平滑肌面積明顯小于哮喘模型。多BCG組優(yōu)于干預(yù)組。
　　 4.2各組大鼠氣道免疫組化CyclinD1、α-SMA的圖像半定量分析，以陽性平均灰度值為統(tǒng)計(jì)量（含量與陽性平均灰度值成反比）：α-SMA:與正常組(126

13、.3609±6.9006)（見Fig3.A）大鼠氣道α-SMA的陽性平均灰度值相比，哮喘組(99.6951±5.8131)（見Fig3.B）、多BCG組(116.6681±9.4061)（見Fig3.C）干預(yù)組(109.4332±5.0131)（見Fig3.D）的明顯減低，有顯著性差異；其中哮喘組比多BCG組和干預(yù)組表達(dá)減低，有顯著性差異，但多BCG組和干預(yù)組多BCG組與干預(yù)組之間沒有顯著性差異。
　　 CyclinD1:與正常

14、對照組(157.7±4.5079)（見Fig4．A）CyclinD1陽性目標(biāo)平均灰度的表達(dá)相比，哮喘模型組(129.8±4.9666)（見Fig4.B）、多BCG組(152.2±5.0692)（見Fig4.C），干預(yù)組(148.3±2.0017)（見Fig4.，D）的陽性平均灰度值明顯減低，有顯著性差異；多BCG組和干預(yù)組較哮喘組表達(dá)增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但多BCG組和干預(yù)組多BCG組與干預(yù)組之間沒有顯著性差異。
　　 5、Cy

15、clinD1與α-SMA及CyclinD1與IFN-γ和IL-4與CyclinD1的相關(guān)分析Pearson相關(guān)分析證明哮喘模型組大鼠肺組織中CyclinD1與α-SMA的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.728，P=0.000);血清中IFN-γ與肺組織中CyclinD1含量（1/平均陽性灰度值）成負(fù)相關(guān)。血清中IL-4與肺組織中CyclinD1含量（1/平均陽性灰度值）成正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、哮喘模型成功建立，哮喘組大

16、鼠在實(shí)驗(yàn)期間出現(xiàn)毛色無光澤、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、體重輕于正常對照組等情況；激發(fā)過程中可見大鼠呼吸急促、煩躁不安、張口呼吸、口唇紫紺、甚至四肢癱軟的表現(xiàn)。而正常對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中無異常表現(xiàn)，飲食、行動(dòng)、呼吸節(jié)律、體重均正常。這為建立哮喘模型組提供依據(jù)。
　　 2、哮喘模型組各大鼠肺組織病理可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯高于正常對照組，血清IL-4水平明顯升高，IFN-γ水平下降，IL-4/IF

17、N-γ比例升高，且均與正常對照組有顯著性差異，提示Th2反應(yīng)在哮喘發(fā)病中占主要的地位。Th1/Th2比例失衡在哮喘發(fā)病中起到重要的作用。
　　 3、多BCG組和BCG干預(yù)組大鼠肺組織病理中的炎性細(xì)胞低于哮喘模型組但高于正常對照組，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例低于哮喘模型組但高于正常對照組，血清IL-4水平低于哮喘模型組但高于正常對照組，IFN-γ水平高于哮喘模型組但低于正常對照組，IL-4/IFN-γ比例低于哮喘模型組

18、，說明BCG可以調(diào)節(jié)Th1/Th2比例平衡，促進(jìn)Th1型反應(yīng)，抑制Th2型反應(yīng)，減輕氣道炎癥。
　　 4、哮喘模型組氣道α-SMA和cyclinD1含量（1/陽性平均灰度值）水平明顯高于正常組且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明哮喘發(fā)病初期即有氣道重塑發(fā)生。行IL-4與cyclinD1（1/陽性平均灰度值）相關(guān)分析成正相關(guān)，α-SMA與cyclinD1相關(guān)分析成正相關(guān)，推測Th2分泌IL-4，進(jìn)而產(chǎn)生各種炎性介質(zhì)刺激cyclinD1的表達(dá)，

19、啟動(dòng)細(xì)胞周期，氣道平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致α-SMA表達(dá)增多。BCG干預(yù)后α-SMA和cyclinD1（1/陽性平均灰度值）水平明顯低于哮喘組，行IFN-γ與cyclinD1（1/陽性平均灰度值）相關(guān)分析成負(fù)相關(guān)，推測BCG可能通過上調(diào)Thl反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生，而IFN-γ可抑制CDK2的活化和cyclinD1的表達(dá)，使G1后期pRb不能高磷酸化，轉(zhuǎn)錄因子E2F失去轉(zhuǎn)錄活性，氣道平滑肌細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化受阻，從而有效地抑制氣道平滑肌增