ITS序列和β-香樹酯醇合成酶基因與甘草酸形成和積累的相關(guān)性研究.pdf

1、甘草酸含量是甘草質(zhì)量的重要標(biāo)志之一，但是不同種的甘草、不同季節(jié)收獲的甘草、不同產(chǎn)地的甘草、同一產(chǎn)地不同的甘草個(gè)體、甘草不同部位的甘草酸都存在含量差異，而且這種差異嚴(yán)重影響甘草藥材的臨床療效及其穩(wěn)定性；而且由于甘草酸含量的差異，導(dǎo)致對(duì)甘草種質(zhì)資源的藥用價(jià)值評(píng)價(jià)難于進(jìn)行。因此，揭示甘草酸形成和積累的機(jī)制，尋找和甘草酸形成和積累相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)探討調(diào)控甘草藥材的質(zhì)量，評(píng)價(jià)藥用甘草種質(zhì)資源具有重要意義。 目前探討基因和活性成分相關(guān)性所選

2、擇的研究對(duì)象包括基因組和單個(gè)基因。以基因組如RAPD、AFLP等為研究對(duì)象，反映的是植物所有差異的總和，不能直接反映活性成分含量的變異。而且化學(xué)成分的差異可能是由有限的遺傳差異決定，基因組變異的聚類可能反映不出其變化；而以單個(gè)基因如matK基因、ITS序列等為研究對(duì)象，如果選定的基因非編碼基因，則只能反映它本身的分化，只有它和反映活性成分含量的基因同步進(jìn)化時(shí)才能反映出活性成分含量的變異?；钚猿煞值墓δ芑虻亩鄳B(tài)性可能更能反應(yīng)活性成分的變

3、化，但功能基因較長(zhǎng)，作為直接選擇指標(biāo)困難較大。為此，可通過通用基因進(jìn)行間接選擇，或通過功能基因進(jìn)行研究，尋找和活性成分含量變異密切相關(guān)的基因，為探討活性成分含量變異的基因機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 為揭示甘草酸的形成機(jī)制，本文首先將實(shí)驗(yàn)材料分成兩組：含甘草酸組和不含甘草酸組，通過比較兩組ITS序列和β-香樹酯醇合成酶基因第一外顯子(簡(jiǎn)稱β-香樹酯醇合成酶基因)的序列差異，試圖揭示甘草酸形成(甘草酸的有無(wú))和基因的相關(guān)性；然后根據(jù)不同甘草酸含

4、量，把實(shí)驗(yàn)材料分成高甘草酸含量組和低甘草酸含量組，通過比較它們的ITS序列和β-香樹酯醇合成酶基因差異，揭示甘草酸積累和基因分化的相關(guān)性；本文還比較了甘草的不同器官的β-香樹酯醇合成酶基因的表達(dá)差異，揭示不同器官中甘草酸積累和基因表達(dá)的相關(guān)性。 主要結(jié)論如下：(1)基于ITS序列和5.8S基因序列差異劃分的基因型和甘草酸形成具有密切關(guān)系。根據(jù)ITS序列差異將甘草屬植物劃分成兩個(gè)基因型，TTCCTG基因型和ACTTGT基因型。其中

5、，TTCCTG基因型均形成甘草酸，ACTTGT基因型不形成甘草酸；根據(jù)5.8S序列也可將甘草屬植物劃分成A和G兩個(gè)基因型，其中，A基因型形成甘草酸，G基因型不形成甘草酸。 (2)黃甘草和脹果甘草、蜜腺甘草和光果甘草的ITS序列完全相同，支持黃甘草和脹果甘草合并，蜜腺甘草和光果甘草合并的分類處理，研究結(jié)果認(rèn)為黃甘草和蜜腺甘草均可作為藥用甘草資源使用。 (3)不形成甘草酸并非由于β-香樹酯醇合成酶基因缺失的原因，因?yàn)楦什輰僦?/p>

6、物中均具有β-香樹酯醇合成酶基因，根據(jù)其多態(tài)性，推測(cè)甘草屬植物形成甘草酸可能和β-香樹酯醇合成酶基因多態(tài)性有相關(guān)性。 (4)甘草不同種群(產(chǎn)地)的β-香樹酯醇合成酶基因存在豐富的多態(tài)性，在19份種質(zhì)資源中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因型，分別是Ⅰ型(TATGAGGT基因型)、Ⅱ型(TATGGGGT基因型)、Ⅲ型(CATGAGGT基因型)、Ⅳ型(TGTGGGGG基因型)、Ⅴ型(CATCACCT基因型)和Ⅵ型(CAACACGT基因型)。前3個(gè)基因型

7、占較大的比例(84％)，后3個(gè)基因型所占比例較小(16％)。其中，Ⅰ型(TATGAGGT基因型)和高含量甘草酸具有密切相關(guān)性。 不同種群(產(chǎn)地)的甘草藥材中甘草酸含量存在明顯差異，但它們之間的ITS序列完全相同，說明ITS序列不能反映甘草酸積累的變化。 (5)甘草β-香樹酯醇合成酶基因的分組和地理來(lái)源、傳統(tǒng)甘草藥材分類(東草和西草)有相關(guān)的趨勢(shì)，但關(guān)系不密切。暗示小環(huán)境在β-香樹酯醇合成酶基因多態(tài)性形成過程中起重要作用，

8、也說明同一產(chǎn)地甘草質(zhì)量的差異可能具有相關(guān)性。 (6)β-香樹酯醇合成酶基因在甘草各部位中的表達(dá)時(shí)間存在差異，不定根表達(dá)β-香樹酯醇關(guān)鍵酶基因的時(shí)間最長(zhǎng)，結(jié)合甘草不同部位的甘草酸含量測(cè)定結(jié)果，認(rèn)為不同器官甘草酸含量差異和基因的表達(dá)時(shí)間具有密切關(guān)系。 本論文的創(chuàng)新之處如下：1.有人利用RAPD對(duì)甘草屬3種植物進(jìn)行了研究，主要研究不同種的親緣關(guān)系或不同種群的親緣關(guān)系；本文對(duì)9種甘草屬植物的ITS序列多態(tài)性和甘草酸形成的相關(guān)性進(jìn)

9、行了分析；系統(tǒng)研究了《中國(guó)植物志》承認(rèn)的8種中的7種甘草的ITS序列，發(fā)現(xiàn)根據(jù)ITS序列多態(tài)性劃分的基因型和甘草酸的形成具有相關(guān)性；本文還利用ITS序列對(duì)黃甘草和蜜腺甘草進(jìn)行了研究，支持黃甘草和蜜腺甘草做為藥用甘草基源使用。 2.有人克隆了光果甘草中β-香樹酯醇合成酶cDNA，本文在此基礎(chǔ)上研究4種甘草屬植物、19份甘草種質(zhì)資源的β-香樹酯醇合成酶基因的多態(tài)性，將其多態(tài)性與甘草酸的形成和甘草酸含量變化結(jié)合起來(lái)，發(fā)現(xiàn)β-香樹酯醇合

10、成酶基因第一外顯子在甘草屬內(nèi)和甘草種內(nèi)均具有多態(tài)性，這種多態(tài)性和甘草酸的形成具有相關(guān)性，而且發(fā)現(xiàn)了一種基因型和高含量甘草酸具有密切的相關(guān)性，對(duì)甘草優(yōu)良品種的篩選具有指導(dǎo)意義。 3.有人對(duì)光果甘草種子發(fā)芽過程中、主根發(fā)育過程中β-香樹酯醇合成酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了研究；本文對(duì)甘草不同部位的β-香樹酯醇合成酶基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)8月份只有不定根表達(dá)β-香樹酯醇合成酶基因，初步說明甘草不同部位甘草酸含量差異是由基因表達(dá)量差異決