淫羊藿總黃酮調控HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質細胞凋亡和再生的研究.pdf

1、背景：超過生理劑量的糖皮質激素長期應用造成下丘腦一垂體一腎上腺(HPA)軸抑制和腎上腺皮質萎縮。突然停藥之后，易致腎上腺皮質功能不全，對機體內環(huán)境穩(wěn)定甚至是生命存在潛在的威脅，為避免疾病復發(fā)和促進腎上腺皮質功能恢復，劑量遞減仍是臨床采用的唯一方法，但需要幾個月甚至是1年以上的時間。因此，尋找新的方法拮抗糖皮質激素對HPA軸的抑制，促進腎上腺皮質功能恢復，是臨床醫(yī)學需要解決的重要命題。 腎上腺皮質功能有賴于腎上腺皮質細胞的數量和功

2、能。研究表明腎上腺皮質外側存在干細胞，腎上腺皮質干細胞在外側增殖、并向內側遷移和分化從而形成腎上腺皮質各個功能層，依次為球狀帶、束狀帶、網狀帶，這種腎上腺皮質再生和另一個細胞生物學過程腎上腺皮質細胞凋亡共同調節(jié)了腎上腺皮質細胞的數量和功能。因此本研究擬從兩個方面研究盯的作用機制。 目的：1、盯對皮質酮誘導HPA軸受抑大鼠。腎上腺皮質細胞過度凋亡的影響及分子機制。2、EF對皮質酮誘導HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質再生的影響及分子機制。

3、 材料與方法：動物：動物采用清潔級SD大鼠，雄性，4月齡。藥物：盯采用遼寧產朝鮮淫羊藿，由上海市醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥室提取。 方法：分為正常對照組、模型組、治療組。模型組皮下注射皮質酮每天5mg／kg，連續(xù)14天。治療組用EF灌胃，于造模前5天開始灌胃直至實驗結束，劑量為每天0．06g／kg。①采用競爭結合免疫分析方法檢測大鼠血漿皮質酮水平，以評價盯治療對HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質功能的保護效果。②檢測大鼠腎上腺重量和采用

4、HE染色對大鼠腎上腺皮質進行組織學觀察，以觀察盯防治腎上腺萎縮的效果。③兩種方法檢測細胞凋亡，采用流式細胞術檢測分離的腎上腺細胞凋亡率；并采用末端轉移酶介導的X—dUTP缺口末端標記(TUNEL)法檢測原位細胞凋亡。④兩種方法檢測細胞增殖，采用流式細胞術檢測細胞周期分布；大鼠處死前1天腹腔注射BrdU，取。腎上腺，BrdU免疫組織化學染色檢測處于DNA合成期的細胞。⑤造模前l(fā)天大鼠腹腔注射BrdU以標記增殖細胞，14天后取腎上腺，采用B

5、rdU免疫組織化學染色法觀察增殖細胞的遷移情況；⑥采用基因芯片和實時定量PCR技術研究EF對細胞凋亡、增殖等過程發(fā)揮作用的分子機制。 結果：l、各組大鼠血漿皮質酮水平：正常對照組、模型組、治療組血漿皮質酮水平分別為：96．03+30．95ng／mI(n=16)、30．72+21．73ng／ml(n=16)、53．79±25．63ng／mI(n=24)，模型組和正常對照組比較，血漿皮質酮水平顯著減低(P

6、比較，血漿皮質酮水平升高(P

7、常對照組、模型組、治療組細胞凋亡率分別為7．91±6．063％、M．42±4．851％、8．62±5．59％，模型組與正常對照組比較顯著升高(P

8、能明顯降低皮質酮大鼠腎上腺皮質細胞過度的細胞調亡。 4、細胞增殖檢測：流式細胞術檢測細胞周期分布結果示正常對照組、模型組、治療組處于GO／G1期細胞比例分別為76．36±L93％、93．40±1．70％、85．70±2．62，與正常對照組比較，模型組顯著升高(P

9、照組比較，模型組顯著降低(p

10、BrdU，對處于增殖狀態(tài)的細胞進行標記，這些標記細胞隨時間而遷移。以球狀帶和束狀帶的分界為界線，14天之后，BrdU免疫組織化學染色結果顯示正常對照組和模型組的標記細胞均位于球狀帶，治療組絕大部分標記細胞位于束狀帶／網狀帶。表明EF能促進被標記的增殖細胞向內側遷移。 6、EF減輕細胞凋亡和促進細胞周期、促進腎上腺皮質分泌功能的分子機制：采用美國Affymetrix公司Ratexpression2302．O基因芯片，基因差異表達(

11、上調或下調)兩倍以上為有意義。發(fā)現模型組與正常對照組比較，上調的基因29個，下調的基因785個，反映皮質酮主要抑制腎上腺基因表達。其中有3個為凋亡相關基因：AMP-activatedproteinkinasealpha1catalyticsubunit、inhibitorofapoptosisprotein1、baculox~irallAPrepeat．Containing4，均具有抗凋亡活性；參與細胞周期的基因有6個，分別是neuro

12、blastomaRASviral(v-ras)oncogenehomolog、nuclearfactorFA、forkheadbox01、V-junsarcomavims17oncogenehomolog(avian)、fibroblastgrowthfactor7(FGF7)、intefieukin1alpha，均具促進細胞周期活性。治療組與模型組比較，上調的基因有237個，下調的基因有122個。其中有2個具抗凋亡活性的基因上調：mi

13、togenactivatedproteinkinase8interactingprotein、insulin-likegrowthfactorII(IGF．II)；有6個是促進細胞周期基因：FGF7、IGF．II、mismatchrepairprotein、retproto-oncogene、v-junsarcomavirus17oncogenehomolog(avian)、prostaglandin-endoperoxidesynth

14、ase2；有7個與皮質類固醇合成相關的基因上調：mevalonatekinase、mevalonatepyrophosphatedecarboxylase、famesyldiphosphatefamesyltransferase1、isopentenyl-diphosphatedeltaisomerase、2,3-oxidosqualeneanosterolcyclase、cytochromeP450subfamily51、farens

15、yldiphosphatesynthase?；虮磉_皮質再生具有重要作用。基因表達譜檢測結果顯示盯明顯上調IGF-II和FGF-7的mRNA表達，根據文獻，IGF和FGF家族與腎上腺皮質細胞表面受體結合后對腎上腺皮質細胞的增殖、分化、類固醇合成多個過程均具有重要的調控作用，因此是調節(jié)。腎上腺皮質再生的重要上游分子；我們對其進行了進一步觀察，分離正常大鼠腎上腺皮質細胞，直接與EF溶液孵育，實時定量PCR技術檢測其基因表達。結果發(fā)現與盯共同

16、孵育后，IGF—IImRNA表達顯著升高(PO．05)。綜合基因芯片和定量PCR結果，IGF—II和FGF7在體內實驗(基因芯片檢測)mRNA表達均顯著上調；并且IGF—IImRNA在體外實驗(直接與EF溶液孵育)也被盯上調，表明IGF-Ⅱ和FGF-7均介導了EF的作用更為重要。 結論： 通過對上述實驗結果的分析，我們認為EF能通過干預以下兩個細胞生物學機制拮抗糖皮質激素

17、對腎上腺皮質功能的抑制： 1、EF能減輕皮質酮誘導的HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質細胞過度凋亡。 2、EF能促進皮質酮誘導的HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質再生。根據大量文獻研究，BrdU標記細胞可認為是腎上腺皮質干細胞，我們采用完全相同的方法，觀察到EF作用后BrdU標記細胞增殖活躍；更多細胞進入細胞周期；促進BrdU標記細胞向內側遷移；多種類固醇合成相關酶基因表達上調。綜上我們認為盯干預了腎上腺皮質干細胞的增殖、遷移、分化的各