嬰幼兒未成熟肺缺血再灌注損傷的特點、機制與保護研究.pdf

1、肺缺血再灌注導致的損傷常見于外科臨床，尤以應用體外循環(huán)(CPB)技術的各類手術及肺移植術后最為突出。術后肺功能障礙對患者的預后有著不容低估的影響，成為影響CPB術后恢復的非心血管并發(fā)癥的首要因素。尤其是在嬰幼兒先心病手術后，此類損傷已成為直接影響術后轉歸的最主要因素。對其發(fā)生機制的研究和尋求有效的防治措施是近年來國內(nèi)外心血管外科共同關注的重要課題。研究者們致力于采用各種手段(如白細胞濾過、缺血預適應等)及藥物干預(如糖皮質(zhì)激素、氧自由基

2、清除劑、蛋白酶抑制劑以及中藥等)來預防或減輕肺缺血再灌注損傷，雖取得一定的效果，但這些方法對嬰幼兒未成熟肺損傷的保護作用并不顯著，相關方面的研究亦少見報道。因此，有必要對此類急性肺損傷病理生理過程進行再認識；積極探索未成熟肺損傷的特點；尋求進一步的、針對性的保護方法；以此達到改善嬰幼兒體外循環(huán)術后肺功能及患者預后的目的；從而提高應用體外循環(huán)技術各類手術效果，特別是對嬰幼兒先心病手術治療水平具有重大意義和臨床應用價值。 據(jù)文獻報道

3、，在大量前炎性細胞因子TNF-a、IL-1β及ROS等通過炎性細胞表面TOLL受體將刺激信號傳遞到胞漿后，髓核細胞分化因子MyD88在調(diào)控其下游的炎癥信號分子表達中起著非常關鍵的作用；并直接影響到靶組織中炎癥細胞的進一步活化和趨化及靶組織中炎癥反應的程度。缺血再灌注導致ROS的過度釋放，并由此引起的氧化應激、線粒體功能下降是缺血再灌注肺損傷的主要病理機制。活性最高、危害最大的是羥自由基(HO)(ie，ROS-HR)，其主要作用靶標是含有

4、大量不飽和脂肪酸的生物膜。MDA作為脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，其含量代表了生物膜不飽和脂肪酸氧化損傷的程度。同樣，GSH-PX和SOD作為細胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，可以反映細胞生物膜的保護能力。依達拉唪(Edaravone，MCI-186)是一種新型自由基清除劑，它可抑制由H2O2和Fe2+反應產(chǎn)生的細胞損傷因子OH，可明顯對抗由羥自由基及鐵離子引起脂質(zhì)過氧化的活性；可抑制水楊酸的羥化作用，與水楊酸競爭而顯示出對。OH的清除作用，從而顯示出其

5、強大的清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用。 由以上分析我們提出本研究的科學假說：(1)在缺血再灌注所致未成熟急性肺損傷中炎癥反應是其最主要的損傷機制，MyD88作為炎癥反應信號轉導通路上較上游的一個關鍵信號分子，通過激活下游的NF-κB進而調(diào)節(jié)靶基因表達水平，影響肺組織炎癥反應的發(fā)生發(fā)展。(2)在炎癥反應引起肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷過程中，ROS對線粒體的損傷是核心，而依達拉唪通過清除自由基，減輕ROS對線粒體的作用，改善肺泡Ⅱ型上皮細

6、胞損傷情況，最終保護未成熟肺的功能。 針對以上科學假說，在本研究工作中，我們選用了成年(5-6月)和嬰幼兒(15-21天)新西蘭白兔，建立在體單肺缺血再灌注損傷模型；ELISA法檢測缺血再灌注過程中各時間點的IL-1β、TNF-a水平；術畢收集肺組織分別進行MDA，ROS-HR濃度及SOD，GSH-PX活性測定； Western blot檢測MyD88和NF-κB水平；并提取肺組織中的線粒體，行膜電位(△ψm)、腫脹率及游離鈣水

7、平測定；光鏡和電鏡分別觀察肺組織病理和超微結構改變。比較、分析成年組與嬰幼兒組缺血再灌注損傷過程中生化、免疫、病理變化特點和規(guī)律；在此基礎上，進一步探討了氧自由基清除劑依達拉唪(Edaravone)預處理對未成熟肺缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。 第一部分成年兔與嬰幼兒兔肺缺血再灌注損傷的比較研究 目的：通過成年兔與嬰幼兒兔肺缺血再灌注損傷的比較研究，探討嬰幼兒兔未成熟肺損傷的特點及其可能的機制。 方法：選

8、用成年(5-6月)和嬰幼兒(15-21天)新西蘭白兔各24只，分別隨機配到成年對照組、成年缺血再灌注組、嬰幼兒對照組、嬰幼兒缺血再灌注組。建立Sakuma單肺缺血再灌注模型，肺門阻斷1h后，開放再灌注4h。收集各時間點的血樣，ELISA法檢測IL-1β、TNF-a水平；術畢收集肺組織分別進行MDA，ROS-HR濃度及SOD，GSH-PX活性測定；Westem blot檢測MyD88和NF-κB水平；光鏡和電鏡分別觀察其組織病理和超微結構

9、改變；并提取肺組織中的線粒體，行膜電位(△ψm)、腫脹率及游離鈣水平測定。 結果：缺血再灌注損傷后，肺組織損傷性變化明顯。與成年兔組相比，嬰幼兒兔組肺組織有更多的白細胞侵潤，肺泡細胞與間隔組織腫脹明顯，肺泡腔內(nèi)有較多的滲液，部分肺泡腔塌陷；出血多見；電鏡觀察下，可見部分肺泡上皮細胞及內(nèi)皮細胞脫落，線粒體腫脹明顯，嵴破裂，甚至消失。線粒體膜電位下降明顯，游離鈣濃度明顯升高；MDA，ROS-HR濃度升高，但兩組存在顯著差異(P<0.

10、01)，SOD，GsH-PX活性下降，也同樣存在顯著差異；缺血再灌注過程中各時點的IL-1β、TNF-a水平也有不同程度升高，特別是再灌注后的2h、4h，(P<0.01)：再灌注后肺組織中MyD88和NF-κB表達也顯著升高。 結論：缺血再灌注可導致急性肺損傷；與成熟肺相比，嬰幼兒未成熟肺損傷更為嚴重。這可能與嬰幼兒相對低的抗氧化能力和產(chǎn)生更多的ROS有關。 第二部分依達拉唪預處理對嬰幼兒未成熟肺損傷保護作用研究

11、 目的：觀察依達拉唪(EdaraVone)預處理對缺血再灌注所致嬰幼兒未成熟肺損傷組織中MDA，ROS-HR，SOD及GsH-Px表達的影響，線粒體損傷改變，探討Edaravone清除氧自由基，減輕線粒體損傷，保護肺功能的作用。 方法：選用嬰幼兒(15-21天)新西蘭白兔各66只，隨機分配到對照組、缺血再灌注組和Edauravone預處理+缺血再灌注組。建立Sakuma單肺缺血再灌注模型，肺門阻斷1h后，開放再灌注4h。Edar

12、aVone按1 mg/kg于缺血前5分鐘，通過耳緣靜脈注射處理；術畢收集肺組織分別進行MDA，ROS-HR濃度及SOD，GSH-PX活性測定；Westemblot檢測MyD88和NF-κB水平；光鏡和電鏡分別觀察其組織病理-和超微結構改變；并提取肺組織中的線粒體，行膜電位(△ψm)、腫脹率及游離鈣水平測定。 結果：依達拉唪預處理組肺組織中MDA，ROS-HR濃度明顯降低，相反SOD及GSII-PX活性明顯升高；同樣，依達拉唪預處

13、理后，明顯抑制缺血再灌注損傷所致的線粒體膜電位(△ψm)的下降，線粒體的腫脹亦明顯減輕；此與電鏡觀察下的肺超微結構改變一致，肺泡上皮與血管內(nèi)皮細胞脫落明顯減少，線粒體形態(tài)趨于正常，腫脹減輕，嵴破裂少；光鏡觀察，依達拉唪預處理組肺泡與肺泡間隔腫脹程度明顯輕于缺血再灌注組，肺泡腔滲液減少，出血少見。由此導致依達拉唪預處理組的生存率(83％)明顯高于缺血再灌注損傷組(50％)。 結論：依達拉唪(Edaravone)可通過清除氧自由基，