氧化損傷在低出生體重仔鼠發(fā)生代謝綜合征過程中的作用及干預研究.pdf

1、研究背景: 近年來的流行病學調查和實驗研究均提示：低出生體重不僅是造成圍產兒死亡和發(fā)病的重要原因，而且還是成年后心血管疾病、糖代謝異常等代謝綜合征(MS)的獨立發(fā)病因素。因此研究低出生體重引起成年期MS的發(fā)病機制并實施相應的干預來早期防治成年期疾病已成為一個研究熱點。 對低出生體重發(fā)生成年期MS的機制已進行了一些研究，但其中機制并未完全明確。2型糖尿病是組成MS的主要疾病之一，它的主要發(fā)病機制包括胰島素抵抗和胰島β細胞功

2、能障礙。近年來研究發(fā)現，氧化損傷在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，氧化損傷可以可以導致胰島β細胞損傷并導致胰島素抵抗。氧化和抗氧化作用失衡所致的氧化損傷引起的胰島β細胞損傷是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的一個重要機制。氧化損傷是指機體在遭受各種有害刺激時，氧自由基的產生和抗氧化防御之間嚴重失衡，從而導致組織損傷，包括生物膜脂質過氧化、細胞內蛋白及酶變性、DNA損害，最后導致細胞死亡或凋亡、疾病發(fā)生。在糖尿病早期，患者胰島附近的脂質過氧化產

3、物丙二醛(MDA)的濃度明顯增高，證實氧自由基在糖尿病的發(fā)病中起作用。目前對有關氧化損傷機制在低出生體重兒發(fā)生代謝綜合征的過程中是否發(fā)揮作用及其作用機制尚缺乏研究。從氧化損傷這一獨特視角來探討低出生體重兒在發(fā)生MS過程中的作用及機制并進行相應預防具有重要意義。 目的: (1)本實驗給予孕鼠10％低蛋白飲食，制造低出生體重仔鼠模型，動態(tài)監(jiān)測低出生體重仔鼠的生長發(fā)育情況。 (2)動態(tài)研究低出生體重仔鼠生后2～3月內的

4、胰島功能與結構的變化：包括血糖水平、血清胰島素水平、胰腺胰島素蛋白含量和β細胞超微結構的變化，并根據血糖與血清胰島素值計算胰島β細胞分泌功能。 (3)研究低出生體重仔鼠體內的氧化損傷狀態(tài)；并進行脂質過氧化產物MDA與胰島β細胞功能之間的相關性研究，以揭示氧化損傷能否導致胰島β細胞損傷。 (4)研究氧化損傷導致胰島β細胞功能與結構改變的機制。 (5)探討L-精氨酸作為抗氧化營養(yǎng)素對低出生體重仔鼠促生長發(fā)育的影響；對

5、胰島細胞功能及結構、對胰島素分泌的影響；進一步從減輕過氧化損傷、促進胰島素合成和分泌、減少胰島細胞凋亡及促進胰島β細胞定向分化這幾個方面，揭示L-精氨酸影響低出生體重仔鼠胰島功能和結構的作用機制。 方法: (1)低出生體重仔鼠模型的建立和實驗分組：采用健康三月齡SD二級雌性和雄性大鼠各18只，按照雌雄1:1的比例同一籠中交配。 (2)低出生體重仔鼠胰島功能、結構的檢測：在仔鼠生后7天、21天、2月齡或3月齡這幾個

6、時間點分別殺鼠取材，檢測以下指標：①測體重，取血測空腹血糖及胰島素值；并根據公式計算胰島β細胞分泌功能。②取胰腺，用免疫組化法及WB方法分別檢測Insulin蛋白的表達及其水平。③制作胰腺電鏡標本，電鏡下觀察胰島β細胞的超微結構。 (3)低出生體重仔鼠氧化損傷狀態(tài)及抗氧化酶的檢測：①取血清檢測脂質過氧化物MDA及抗氧化酶SOD、GSH-PX的水平。②制作胰腺勻漿、心肌勻漿及腦組織勻漿，分別檢測MDA、SOD及GSH-PX的水平。

7、③進行脂質過氧化產物MDA水平與3月齡血糖值、胰島素蛋白水平和胰島β細胞分泌功能的相關性分析。 (4)氧化損傷機制對胰島功能、結構影響的作用機制研究：①取胰腺，用免疫組化法及WB方法分別檢測NF-kB蛋白在胰腺中的表達及其水平。②采用RT-PCR方法檢測胰腺組織的Insulin、Bax及Bcl-2基因的mRNA表達。 (5)L-Arg干預后對低出生體重仔鼠生長的影響及對胰島功能與結構的影響和機制研究：①動態(tài)監(jiān)測仔鼠的體重

8、增長情況；②測血糖及胰島素值，計算胰島β細胞分泌功能；③檢測血清MDA、SOD、GSH-PX及NO水平；④取胰腺，分別用免疫組化法和WB方法檢測Insulin蛋白、NF-kB蛋白及PDX-1蛋白的表達及其水平；⑤取胰腺，用RT-PCR法測Insulin、Bax及Bcl-2基因的mRNA表達；⑥電鏡下觀察胰島β細胞的超微結構。 (6)統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數士標準差(x±s)表示，兩組

9、間均數比較采用t檢驗。樣本間率的比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Bivariate直線相關分析，計算Pearson相關系數。P<0.05視為差異有顯著性。 結果: (1)建立了低出生體重仔鼠模型：10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，可使其仔鼠出生體重下降，且較多達到IUGR的標準；而且每窩產仔數和圍產期死亡率較正常組無明顯差異。低出生體重仔鼠在生后2月內體重一直低于正常組，但隨后出現快速的體重增加，生后3月齡時低出生體重仔鼠體重已

10、追趕上正常組。 (2)低出生體重仔鼠胰島功能、結構的變化：①模型組3月齡時出現明顯的空腹高血糖癥。②正常組和模型組兩組間各時間點的血清胰島素水平無顯著性差異；但模型組在生后2月齡及3月齡時胰島β細胞分泌功能明顯弱于正常組。③各時間點的低出生體重仔鼠Insulin蛋白水平均顯著低于正常組；低出生體重仔鼠胰腺的Insulin mRNA的表達水平明顯低于正常組。④胰腺超微結構顯示，低出生體重仔鼠生后2月齡時胰島β細胞的內分泌顆粒明顯減

11、少，并出現脫顆粒和蒼白顆?，F象。 (3)脂質過氧化產物MDA及抗氧化酶的檢測：①各時間點的低出生體重仔鼠血清MDA值均顯著高于正常組；低出生體重仔鼠的血清SOD、GSH-PX值均顯著低于正常組。②檢測胰腺、心肌及腦組織勻漿亦有類似結果。 (4)氧化損傷狀態(tài)與胰島內分泌功能之間的相關性：通過相關性分析，發(fā)現血清及胰腺勻漿MDA值與大鼠生后3月齡血糖值之間存在明顯正相關；血清及胰腺勻漿MDA值與大鼠生后2月齡胰島素蛋白水平和

12、胰島β細胞分泌功能之間存在明顯負相關。 (5)氧化損傷機制對胰島功能、結構影響的作用機制研究：①低出生體重仔鼠胰腺核因子NF-kB蛋白水平明顯高于正常組。②低出生體重仔鼠胰腺的抑制凋亡基因Bcl-2mRNA的表達水平明顯低于正常組；促凋亡基因BaxmRNA的表達水平高于正常組。 (6)L-Arg干預后對低出生體重仔鼠生長及氧化損傷狀態(tài)的影響：①于生后早期給予L-Arg干預治療后，可使低出生體重仔鼠出現生長追趕現象。至生后

13、21天、2月齡時，干預組的體重與正常組相比已無顯著性差異。②L-Arg干預治療后，可以使低出生體重仔鼠的血清MDA水平下降，并能增加血清SOD的含量。③正常組血清一氧化氮(NO)水平最高，模型組最低。L-Arg干預后能增加低出生體重仔鼠的血清NO水平，使其在生后21天及2月時接近正常組仔鼠的NO水平。 (7)L-Arg干預后對低出生體重仔鼠胰腺功能、結構的影響和機制研究：①生后2月齡時，干預組大鼠胰島β細胞分泌功能較模型組有明顯

14、改善，已接近于正常組。②干預組大鼠在生后21天及2月時Insulin蛋白及InsulinmRNA表達水平較模型組均有明顯增加。③2月齡時，模型組PDX-1蛋白含量最低；L-Arg干預后可以促進低出生體重仔鼠的PDX-1蛋白表達，使其接近于正常組水平。④模型組大鼠胰腺NF-kBp65蛋白的表達最強，正常組NF-kBp65蛋白的表達最弱；L-Arg干預后可以降低低出生體重仔鼠的NF-kBp65蛋白表達。⑤L-Arg干預可以上調大鼠胰腺Bcl

15、-2mRNA的表達，下調BaxmRNA的表達。⑥L-Arg早期干預后，可明顯增加低出生體重仔鼠的胰島β細胞內分泌顆粒，減少脫顆粒及蒼白顆?，F象。 結論: (1)10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，是一種有效的制造低出生體重仔鼠模型的方法。生后3月齡時，低出生體重仔鼠出現體重快速增加、空腹血糖值增高，有發(fā)生成年期代謝綜合征的傾向。 (2)生后2月齡及3月齡時，模型組大鼠的胰島p細胞分泌功能降低；Insulin蛋白及Insul

16、inmRNA水平低于正常組；出現胰島β細胞超微結構的改變，表現為內分泌顆粒明顯減少。提示低出生體重仔鼠存在胰島功能的損傷和超微結構的改變。 (3)模型組大鼠體內的過氧化損傷嚴重，抗氧化酶水平低下。相關性分析表明機體的氧化損傷狀態(tài)與其成年期高血糖癥之間具有顯著的正相關性，與機體的胰島素合成、分泌功能低下之間具有顯著的負相關性，說明氧化損傷導致了胰島β細胞的功能受損。提示氧化損傷機制在低出生體重仔鼠發(fā)生成年期代謝綜合征的過程中起重要

17、作用。 (4)低出生體重仔鼠存在NF-kBp65蛋白水平升高，并出現促凋亡基因BaxmRNA表達的增強和抑凋亡基因Bcl-2mRNA表達的減弱。提示氧化損傷對胰島功能和結構的影響與NF-kB蛋白的激活、Bcl-2/Bax平衡的改變而導致的胰島細胞凋亡增多有關。 (5)生后早期補充L-Arg對低出生體重仔鼠具有促生長追趕的作用。 (6)生后早期補充L-Arg可以通過增強抗氧化酶SOD的活性和增加血清NO的水平來減輕