水分脅迫下叢枝菌根真菌調(diào)控寧夏枸杞抗旱以及磷代謝的機(jī)制研究.pdf

1、本研究以寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）和叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌根內(nèi)球囊霉（Rhizophagus irregularis）為材料，通過分析不同程度水分脅迫下AM真菌對寧夏枸杞水分狀況、光合、糖水平和磷水平的影響，著重從AM共生體“碳磷交換”的磷入手，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、CODE-HOP同源克隆、RACE、酵母突變體互補(bǔ)、煙草瞬時(shí)表達(dá)、激光掃描共聚焦顯微等技術(shù)和方法，系統(tǒng)研究

2、了水分脅迫下AM誘導(dǎo)和非AM誘導(dǎo)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)對寧夏枸杞磷吸收和再分布的響應(yīng)，揭示了水分脅迫下叢枝菌根真菌調(diào)控寧夏枸杞抗旱及磷代謝的機(jī)制。取得如下主要結(jié)果和結(jié)論:
　　1.寧夏枸杞根際AM真菌群落對菌絲室磷處理的響應(yīng)
　　本研究利用寧夏枸杞根際土在自主研制的分層培養(yǎng)花盆中進(jìn)行富集培養(yǎng)AM真菌，并對分層培養(yǎng)花盆的菌絲室施加磷處理以檢測宿主植物根系A(chǔ)M真菌群落是否受影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AM真菌在高磷處理的菌絲室大量產(chǎn)孢;單

3、孢PCR鑒定顯示，根內(nèi)球囊霉(R.irre gularis)是優(yōu)勢菌;菌絲室的低磷處理提高了寧夏枸杞根系A(chǔ)M真菌物種豐富度。結(jié)果表明，菌絲室高磷處理的方法適用于擴(kuò)繁AM真菌，菌絲室低磷處理下寧夏枸杞會采取“多多益善”的策略招募AM真菌。
　　2.水分脅迫下AM真菌對寧夏枸杞水分、光合和糖水平的影響
　　通過在均溫30℃的夏季設(shè)置不同程度水分脅迫，檢測接菌（R.irregularis）與對照的寧夏枸杞植株葉片水分狀況、根系水孔

4、蛋白表達(dá)、葉片溫度、葉片氣體交換和葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及植株糖水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常水分條件和輕度水分脅迫下，與對照相比，接菌植株的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著增加，接菌植株的葉片相對水分含量和葉片溫度顯著降低;與對照相比，接菌植株上調(diào)了根系上水孔蛋白基因LbPIP2-1、Lb TIP3-1以及根內(nèi)球囊霉水孔蛋白基因Rir-AQP2;接菌植株在正常水分條件下的糖類水平與對照植株在輕度水分脅迫下的相似。重度水分脅迫降低了對照植株葉片的光化學(xué)反應(yīng)，不

5、影響接菌植株葉片的光化學(xué)反應(yīng)。結(jié)果表明，接菌植株在應(yīng)對炎熱夏季的輕度水分脅迫時(shí)明顯優(yōu)于對照植株，接菌植株在重度水分脅迫下仍能進(jìn)行正常的光化學(xué)反應(yīng)，有著劇烈的糖水平變化。
　　3.水分脅迫下AM真菌對寧夏枸杞磷表現(xiàn)的影響
　　通過檢測不同程度水分脅迫下接菌（R.irregularis）和對照植株的生長、磷含量、葉片花青素含量以及根系酸性磷酸酶活性，發(fā)現(xiàn)重度水分脅迫降低了接菌和對照植株的葉片生物量，增加了對照植株的葉片花青素含量

6、。在不同程度水分脅迫下，與對照相比，接種AM真菌(R.irregularis)顯著增加了根、莖生物量以及整體磷含量，降低了葉片花青素含量。結(jié)果表明，水分脅迫間接導(dǎo)致了植物的磷缺乏，AM真菌在水分脅迫下向植物供應(yīng)了充足的磷。
　　4.寧夏枸杞磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和啟動子區(qū)域的擴(kuò)增
　　通過同源克隆策略和High-tail PCR技術(shù)，得到寧夏枸杞PHT1家族的6個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(LbPT1～LbPT5、LbPT7)和相

7、應(yīng)的啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)6個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有PHT1家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征，6個(gè)啟動子區(qū)域和其他植物PHT1家族同源基因啟動子區(qū)域具有類似的順式作用元件（P1BS、PHO、MYCS等）。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析和啟動子區(qū)域順式作用元件分析，推測LbPT3、LbPT4和LbPT5是AM誘導(dǎo)的。結(jié)果表明，寧夏枸杞的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與茄科模式植物番茄（Lycopersicon esculentum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）和煙草（N

8、icotiana tabacum）等的同源基因具有相同的進(jìn)化模式。
　　5.寧夏枸杞磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酵母突變體互補(bǔ)和亞細(xì)胞定位分析
　　通過對6個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證和亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)LbPT1、LbPT3和LbPT7具有酵母高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHO84的磷轉(zhuǎn)運(yùn)和磷感應(yīng)功能，LbPT1不具有PHO84磷感應(yīng)的功能;酵母亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)LbPT1、LbPT3和LbPT7位于細(xì)胞膜，LbPT2集中于膜上幾點(diǎn)，LbPT4和L

9、bPT5分散于細(xì)胞內(nèi);煙草亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)LbPT1、LbPT2、LbPT4、LbPT5和LbPT7定位于煙草葉片的細(xì)胞質(zhì)膜，LbPT3定位于煙草根系的細(xì)胞質(zhì)膜。結(jié)果表明，LbPT1、LbPT3和LbPT7磷轉(zhuǎn)運(yùn)功能的實(shí)現(xiàn)與它們在酵母細(xì)胞中正確的定位相關(guān)，6個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均定位于煙草的細(xì)胞質(zhì)膜，但LbPT3的正確定位可能需要根系上的轉(zhuǎn)錄后修飾過程。
　　6.水分脅迫下AM真菌對寧夏枸杞磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響
　　通

10、過檢測磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)M真菌（R.irregularis）共生、磷處理以及不同程度水分脅迫處理的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，明確了LbPT3、LbPT4和LbPT5在低磷條件下被AM真菌共生所誘導(dǎo);LbPT1、LbPT2和LbPT7在根系和葉片上均表達(dá)，且三者在衰老的葉片上轉(zhuǎn)錄水平增加;高磷會抑制這6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄;輕度水分脅迫會上調(diào)LbPT1、LbPT2和LbPT7在對照植株根系和葉片中的表達(dá)，水分脅迫不影響LbPT3、LbPT4和LbPT5在接菌

11、根系上的轉(zhuǎn)錄水平;水分脅迫會上調(diào)LbPT1在接菌根系上的表達(dá)。結(jié)果表明，寧夏枸杞和其他茄科植物一樣，有3個(gè)AM誘導(dǎo)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（LbPT3、LbPT4和LbPT5）;輕度水分脅迫導(dǎo)致的磷缺乏誘導(dǎo)了LbPT1、LbPT2和LbPT7在植物上的表達(dá)，使其在根部行使磷吸收功能以及在地上部分進(jìn)行磷的再分布;水分脅迫下AM途徑的磷吸收十分高效，滿足了根系的磷需求，且接菌植物調(diào)動LbPT1將根系中的磷轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分。
　　7.乙烯對于

12、寧夏枸杞LbPT7的誘導(dǎo)作用
　　通過對接菌（R.irregularis）和對照的根系進(jìn)行不同磷水平下乙烯處理，檢測不同處理?xiàng)l件下AM真菌定殖率和LbPT7的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙烯前體的添加使低磷條件下叢枝的定殖率降低了55.3％，使高磷條件下叢枝的定殖率提高了3.6倍;發(fā)現(xiàn)乙烯在低磷條件下誘導(dǎo)了LbPT7的表達(dá)，高磷條件下乙烯沒有誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，乙烯在低磷條件下通過上調(diào)LbPT7來提高植物直接磷吸收途徑，并抑制菌根磷吸收途徑