叢枝菌根真菌14--3--3蛋白在共生信號(hào)傳導(dǎo)以及非生物脅迫反應(yīng)的作用研究.pdf

1、叢枝菌根(AM)真菌是一種土傳真菌，屬于古老的球囊菌門(mén)，是叢枝菌根的重要共生體，增強(qiáng)植物養(yǎng)分的獲取和對(duì)各種非生物逆境的抗性的重要來(lái)源。與其顯著的生理意義相反，所涉及的分子基礎(chǔ)尚不清楚，主要是由于它們的專(zhuān)性生物營(yíng)養(yǎng)和復(fù)雜的遺傳學(xué)。
　　14-3-3蛋白是一種高度保守的蛋白質(zhì)家族，它廣泛存在于真核細(xì)胞中，14-3-3的同源或異源二聚體可以通過(guò)與其它蛋白質(zhì)相互作用參與真核生物的信號(hào)傳導(dǎo)和代謝活性。
　　本實(shí)驗(yàn)以摩西球囊霉（Funn

2、eliformis mosseae）的Fm201EST Tag為起點(diǎn)，分別從摩西球囊霉（Funneliformis mosseae）和根內(nèi)球囊霉（Rhizophagus irregularis）中分離和鑒定了三個(gè)編碼叢枝菌根真菌14-3-3like蛋白的編碼基因，并分別命名為Fm201，Ri14-3-3和RiBMH2。通過(guò)熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)Fm201，Ri14-3-3和RiRMH2的表達(dá)量在前共生（孢子萌發(fā)）和共生階段（附著胞形成，根內(nèi)

3、菌絲形成，叢枝形成時(shí)期）中都出現(xiàn)了明顯的激增。因?yàn)槿狈τ行У膮仓婢D(zhuǎn)化系統(tǒng)，為了Fm201，Ri14-3-3和RiBMH2基因編碼的功能，引入了酵母異源驗(yàn)證系統(tǒng)。釀酒酵母的14-3-3的雙突變（bmh1，bmh2）是致死的，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在突變酵母BMH2時(shí)引入一個(gè)半乳糖誘導(dǎo)的Ga17啟動(dòng)子啟動(dòng)的叢枝菌根真菌14-3-3基因。數(shù)據(jù)表明，所有三個(gè)14-3-3like基因編碼蛋白在半乳糖培養(yǎng)基中均可以恢復(fù)釀酒酵母bmh1，bmh2致死雙突

4、變的正常代謝表型。
　　此外，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)Fm201基因進(jìn)行3'RACE和5'RACE時(shí)，分別在它的5'UTR和3'UTR中各發(fā)現(xiàn)了一個(gè)內(nèi)含子（或稱(chēng)為選擇性剪接外顯子）。5'UTR的內(nèi)含子被認(rèn)為參與了基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)，而3'UTR內(nèi)含子的出現(xiàn)時(shí)由加尾信號(hào)的選擇性識(shí)別引起的，這些被認(rèn)為是高真核生物的基因調(diào)控機(jī)制。在對(duì)菌根共生過(guò)程中的Fm201L(含有長(zhǎng)的3'UTR)和Fm201S（含有短的3'UTR））進(jìn)行熒光定量分析是，且長(zhǎng)短不同的F

5、m201在共生的不同時(shí)期出現(xiàn)了不同比例的波動(dòng)。為了揭示這兩種選擇性剪切的內(nèi)含子在14-3-3轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中的作用。分別以YGPF為報(bào)告基因，以酵母BY4741為宿主分別檢測(cè)了5'UTR的轉(zhuǎn)錄活性和3'UTR在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，F(xiàn)m201的UTRs可能對(duì)穩(wěn)定RNA或增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄具有重要意義。
　　在對(duì)這三個(gè)14-3-3蛋白進(jìn)行啟動(dòng)子分析(ATG上游1.5Kb序列)時(shí)，在酵母啟動(dòng)子相似的位置上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與非生物脅迫相關(guān)

6、的STRE(CCCCT/AGGGG)順式作用元件。重要的是，酵母單雜交分析表明，叢枝菌根真菌轉(zhuǎn)錄因子RiMsn2（酵母中STRE順式作用元件識(shí)別因子Msn2的同源蛋白）能夠識(shí)別存在于Fm201基因啟動(dòng)子區(qū)的STRE元件。不僅如此，在酵母中當(dāng)對(duì)Fm201的STRE元件進(jìn)行點(diǎn)突變時(shí)，報(bào)告基因在非生物脅迫反映下的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的下降。
　　為了探索14-3-3蛋白在菌根共生關(guān)系維持過(guò)程中的作用，引入了宿主介導(dǎo)的基因沉默(Host In

7、duced Gene Silence)。當(dāng)對(duì)根內(nèi)球囊霉-蒺藜苜蓿共生體中的叢枝菌根真菌Ri14-3-3和RiBMH2基因進(jìn)行沉默時(shí)時(shí)，共生體中的叢枝出現(xiàn)了早衰（或稱(chēng)為提前降解）的現(xiàn)象。不僅如此，苜蓿一側(cè)與菌根叢枝形成相關(guān)的MtPT4和MtMST2基因的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。這些現(xiàn)象均說(shuō)明了叢枝菌根真菌14-3-3蛋白在共生關(guān)系的維持過(guò)程具有十分重要的意義。
　　進(jìn)一步將叢枝菌根真菌和苜蓿蒺藜的菌根共生系統(tǒng)進(jìn)行干旱或鹽分脅迫等非生