黑升麻制劑治療GnRh-a所致圍絕經(jīng)期癥狀的臨床評(píng)估與機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(Endometrio sis，EMS)是雌激素依賴性疾病，術(shù)后易復(fù)發(fā)。術(shù)后使用抑制雌激素合成的藥物促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(Gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a)，能有效抑制垂體分泌促性腺激素，導(dǎo)致卵巢激素水平明顯下降，促使異位子宮內(nèi)膜萎縮，從而能夠較好的起到預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的作用。應(yīng)用GnRH-a可導(dǎo)致繼發(fā)性的低雌激素癥狀，即圍絕經(jīng)期癥狀，是患者放棄進(jìn)一步治療的主要原因

2、。以性激素為基礎(chǔ)的反向添加治療，雖然很好解決了這種圍絕經(jīng)期癥狀，但長(zhǎng)期使用激素可能會(huì)引起EMS的復(fù)發(fā)，且引起的肝功能損害、靜脈栓塞、乳腺癌等風(fēng)險(xiǎn)一直是業(yè)界爭(zhēng)論的熱點(diǎn)，因此，尋求有效、安全的反添加藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外研究表明，作為一種植物提取物，黑升麻制劑(isopropanolic extract of cimicifuga racemosa，ICR)能較好地緩解自然絕經(jīng)所致的圍絕經(jīng)期癥狀，目前亦有研究初步證實(shí)黑升麻制劑能拮

3、抗EMS患者術(shù)后使用GnRH-a治療出現(xiàn)的圍絕經(jīng)期癥狀。然而，黑升麻制劑治療GnRH-a所致圍絕經(jīng)期癥狀的臨床療效與安全性，其發(fā)揮臨床效應(yīng)的作用機(jī)制以及黑升麻制劑能否同雌激素一樣具有較好的骨質(zhì)保護(hù)作用，目前尚未完全明確，值得進(jìn)一步深入探討與研究。
　　本研究主要分為四個(gè)部分，第一部分應(yīng)用臨床病例對(duì)照研究初步評(píng)估黑升麻制劑治療EMS患者術(shù)后使用GnRH-a所致圍絕經(jīng)期癥狀的療效與安全性;第二部分建立GnRH-a所致的圍絕經(jīng)期癥狀大鼠

4、模型，評(píng)估此方法建立圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型的可行性，并初步探討黑升麻制劑對(duì)大鼠模型生殖內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)的影響;第三部分探討黑升麻制劑對(duì)GnRH-a致圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)代謝途徑的影響，以初步明確黑升麻制劑發(fā)揮臨床效應(yīng)的作用機(jī)制;第四部分初步探討黑升麻制劑對(duì)GnRH-a致圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型骨代謝的影響。通過(guò)上述研究，探討黑升麻制劑治療GnRH-a所致圍絕經(jīng)期癥狀的療效與安全性，以及黑升麻制劑發(fā)揮臨床效應(yīng)的作用機(jī)制，進(jìn)而

5、為臨床上EMS患者術(shù)后使用GnRH-a的反向添加治療提供一種安全有效的替代方案與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分黑升麻制劑用于子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后使用GnRH-a所致圍絕經(jīng)期癥狀的療效與安全性研究
　　目的:探討黑升麻制劑用于EMS患者術(shù)后使用GnRH-a治療所致的圍絕經(jīng)期癥狀的臨床療效及其安全性。
　　方法:選擇2010年7月～2013年3月EMS術(shù)后使用GnRH-a治療的116例患者為研究對(duì)象，隨機(jī)分為兩組，其中黑升麻制

6、劑組56例，在GnRH-a治療的同時(shí)給予黑升麻制劑口服，20mg，Bid，連續(xù)用藥12周;替勃龍組60例，在GnRH-a治療的同時(shí)給予替勃龍片口服，2.5mg，Qd，連續(xù)用藥12周。以Kupperman絕經(jīng)期指數(shù)(KMI)總分以及潮熱出汗評(píng)分為主要療效指標(biāo)，在GnRH-a治療前、治療第4、8、12周時(shí)進(jìn)行觀察比較;同時(shí)檢測(cè)兩組患者GnRH-a用藥12周前后患者肝腎功能、血脂、子宮內(nèi)膜厚度及血清性激素水平變化，記錄兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況以比

7、較分析兩種藥物的毒副作用。
　　結(jié)果:(1) GnRH-a治療前黑升麻制劑組與替勃龍組KMI總分及潮熱出汗評(píng)分之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。且GnRH-a治療前，兩組肝腎功能、血脂四項(xiàng)、血清性激素水平及子宮內(nèi)膜厚度無(wú)顯著性差異(P＞0.05);(2)兩組患者治療第4周、第8周和第12周時(shí)，KMI總分及潮熱出汗評(píng)分較治療前均明顯上升(P＜0.05)。同一治療時(shí)間相比，黑升麻制劑組與替勃龍組KMI總分及潮熱出汗評(píng)分之間無(wú)顯著性

8、差異(P＞0.05);(3)兩組患者自身比較，肝腎功能、血脂分析治療前后無(wú)顯著性變化(P＞0.05);(4)兩組患者治療后的子宮內(nèi)膜厚度與自身治療前相比明顯降低(P＜0.05)，兩組患者治療后的子宮內(nèi)膜厚度之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05);(5)在性激素變化方面，兩組患者自身比較，F(xiàn)SH、LH、E2在治療后明顯低于治療前(P＜0.05)，而替勃龍組治療后的E2水平明顯高于黑升麻制劑組(P＜0.05)，F(xiàn)SH、LH水平明顯低于黑升麻制劑組

9、(P＜0.05);(6)不良反應(yīng)方面，替勃龍組陰道出血、乳房脹痛等發(fā)生率明顯高于黑升麻制劑組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:黑升麻制劑治療EMS患者術(shù)后使用GnRH-a治療出現(xiàn)的圍絕經(jīng)期癥狀的效果與替勃龍相似，其對(duì)患者肝腎功能、血脂、血清激素水平、子宮內(nèi)膜厚度無(wú)明顯影響。相比替勃龍，黑升麻制劑不良事件發(fā)生率低，副作用小，可能更為安全。
　　第二部分 GnRH-a致圍絕經(jīng)期大鼠模型的建立及黑升麻制劑對(duì)大鼠模型生殖內(nèi)分泌的影響

10、r>　　目的:建立GnRH-a注射所致的圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)，初步探討黑升麻制劑對(duì)該大鼠模型生殖內(nèi)分泌的影響。
　　方法:采用GnRH-a注射的方法建立圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型，以生理鹽水(NS)注射作為對(duì)照。根據(jù)造模方法與藥物干預(yù)方案的不同將大鼠隨機(jī)分成4組。GnRH-a注射+生理鹽水干預(yù)組(GnRH-a+NS)，生理鹽水注射對(duì)照+生理鹽水干預(yù)組(NS+NS)，GnRH-a注射+雌二醇干預(yù)組（GnRH-a+E

11、2），GnRH-a注射+黑升麻制劑干預(yù)組(GnRH-a+ICR)。陰道涂片方法鑒定造模成功后，給予相應(yīng)的藥物干預(yù)28d;大鼠建模及藥物干預(yù)過(guò)程中，隔日測(cè)定大鼠尾巴皮膚溫度及肛門溫度，并隔日測(cè)量大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。干預(yù)結(jié)束后檢測(cè)各組大鼠血清性激素水平，子宮重量、子宮指數(shù)及子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化，卵巢重量、卵巢指數(shù)及卵巢組織形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:(1)對(duì)照組(NS+NS)大鼠陰道細(xì)胞涂片呈現(xiàn)動(dòng)情周期變化，其余模型組成模

12、大鼠均無(wú)陰道細(xì)胞動(dòng)情周期;(2) GnRH-a+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著高于NS+NS對(duì)照組，E2及ICR的干預(yù)可以延緩GnRH-a所致的大鼠體重增加趨勢(shì);(3) GnRH-a注射后大鼠尾部及肛門溫度總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，E2及ICR的干預(yù)可有效改善這種溫度的變化;(4) GnRH-a+NS，GnRH-a+E2，GnRH-a+ICR組E2、FSH、LH水平均明顯低于NS+NS組(P＜0.01)，Gn

13、RH-a+E2組E2水平明顯高于且LH水平明顯低于GnRH-a+NS與GnRH-a+ICR組(P＜0.05)，與GnRH-a+NS及GnRH-a+ICR組相比，GnRH-a+E2組FSH水平略有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而GnRH-a+NS與GnRH-a+ICR兩組之間性激素水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05);(5)與NS+NS組比較，GnRH-a+NS，GnRH-a+E2，GnRH-a+ICR組子宮重量及子宮指數(shù)均明

14、顯下降(P＜0.01)，組間比較，GnRH-a+NS及GnRH-a+ICR組子子宮重量及宮指數(shù)均明顯小于GnRH-a+E2組(P＜0.01);而GnRH-a+NS與GnRH-a+ICR組之間子宮重量及子宮指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(6)與NS+NS組比較，GnRH-a+NS組，GnRH-a+E2，GnRH-a+ICR組卵巢重量及卵巢指數(shù)均明顯下降(P＜0.01);GnRH-a+E2，GnRH-a+NS及GnRH-a+ICR組三組

15、之間卵巢重量及卵巢指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(7)與NS+NS組比較，GnRH-a+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組原始卵泡數(shù)目明顯增多，而生長(zhǎng)卵泡及成熟卵泡數(shù)目明顯減少(P＜0.01)，但總卵泡數(shù)四組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:GnRH-a注射可以達(dá)到預(yù)期效果，該動(dòng)物模型成功實(shí)現(xiàn)了大鼠體內(nèi)E2、FSH及LH水平均顯著下降的情況，可引起大鼠出現(xiàn)類似圍絕經(jīng)期潮熱的體表溫度升高的反應(yīng)，而E2及

16、ICR的干預(yù)可有效改善這種“圍絕經(jīng)期癥狀”，且ICR對(duì)大鼠血清性激素水平無(wú)明顯影響。
　　第三部分黑升麻制劑對(duì)GnRH-a致圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)代謝途徑的影響
　　目的:探討黑升麻制劑對(duì)GnRH-a注射所致圍絕經(jīng)癥狀大鼠模型5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)代謝途徑的影響。
　　方法:采用GnRH-a注射的方法建立圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型，以生理鹽水(NS)注射作為對(duì)照。根據(jù)造模方法與藥物干預(yù)方案的不同將大鼠隨機(jī)

17、分成4組:GnRH-a注射+生理鹽水干預(yù)組(GnRH-a+NS)，生理鹽水注射對(duì)照+生理鹽水干預(yù)組(NS+NS)，GnRH-a注射+雌二醇干預(yù)組(GnRH-a+E2)，GnRH-a注射+黑升麻制劑干預(yù)組(GnRH-a+ICR)。陰道涂片方法鑒定造模成功后，給予相應(yīng)藥物干預(yù)28d。干預(yù)結(jié)束后處死大鼠，提取大鼠血清、腦脊液及腦組織，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)血清及腦脊液中5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)及色氨酸

18、(TRP)水平的變化;采用免疫組化法(IHC)檢測(cè)各組大鼠模型下丘腦視前區(qū)(POAH)5-HT1A受體(5-HT1AR)、5-HT2A受體(5-HT2AR)含量，大腦中縫核內(nèi)色氨酸羥化酶(TPH)含量，海馬及基底外側(cè)杏仁核中5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)含量，下丘腦視前區(qū)及杏仁核中單胺氧化酶-A(MAO-A)含量;熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)上述部位腦組織中的5-HT1AR mRNA、5-HT2AR mRNA和TPH mRNA、SER

19、TmRNA及MAO-A mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)四組大鼠模型血清5-HT及5-HIAA水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與NS+NS組比較，GnRH-a+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組血清TRP水平均明顯上升(P＜0.01);組間比較，GnRH-a+ICR及GnRH-a+E2組血漿TRP水平均明顯低于GnRH-a+NS組(P＜0.01);而GnRH-a+ICR與GnRH-a+E2組血清TRP水平之間無(wú)統(tǒng)

20、計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(2) GnRH-a+NS組腦脊液中5-HT水平明顯低于NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組，TRP及5-HIAA水平明顯高于其他三組(P＜0.01)，而NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組腦脊液中5-HT水平、TRP水平及5-HIAA水平之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(3)下丘腦視前區(qū)(POAH)5-HT1AR蛋白水平在四組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，GnRH-a

21、+NS組較其他其他三組有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，5-HT2AR水平在GnRH-a+NS組明顯高于NS+NS, GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.05),NS+NS, GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(4)中縫背核(DRN)內(nèi)TPH蛋白含量GnRH-a+NS組明顯低于NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.01)，而NS+NS，

22、GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中縫正中核(MRN)內(nèi)TPH蛋白含量GnRH-a+NS組明顯低于NS+NS、GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.01, P＜0.05, P＜0.01)，而NS+NS, GnRH-a+E2及GnRH-a+ICP組三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(5)海馬區(qū)SERT蛋白表達(dá)水平GnRH-a+NS組明顯高于NS+NS，GnRH-a+E2及

23、GnRH-a+ICR組(P＜0.01)，NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，杏仁核SERT蛋白水平GnRH-a+NS組明顯高于NS+NS，GnRH-a+E2及 GnRH-a+ICR組(P＜0.05)，NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(6)下丘腦視前區(qū)(POAH)MAO-A蛋白水平GnRH-a+NS組明顯高于NS+N

24、S，G-nRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，杏仁核MAO-A蛋白水平GnRH-a+NS組明顯高于NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.05)，NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(7) qPCR法檢測(cè)上述部位

25、腦組織中的5-HT1AR mRNA，5-HT2AR mRNA，TPH mRNA，SERT mRNA及MAO-A mRNA的表達(dá)結(jié)果與相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況大致類似。
　　結(jié)論:5-HT的代謝系統(tǒng)在外周與中樞存在兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的系統(tǒng)，黑升麻制劑可能主要作用于中樞5-HT的代謝系統(tǒng);黑升麻制劑可能主要通過(guò)對(duì)中樞5-HT代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響而發(fā)揮其臨床效應(yīng)。
　　第四部分黑升麻制劑對(duì)GnRH-a致圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型骨代謝影響的初步研

26、究
　　目的:初步探討黑升麻制劑對(duì)GnRH-a注射所致圍絕經(jīng)癥狀大鼠模型骨代謝的影響。
　　方法:采用GnRH-a注射的方法建立圍絕經(jīng)期癥狀大鼠模型，以生理鹽水(NS)注射作為對(duì)照。根據(jù)造模方法與藥物干預(yù)方案的不同將大鼠隨機(jī)分成4組。GnRH-a注射+生理鹽水干預(yù)組(GnRH-a+NS)，生理鹽水注射對(duì)照+生理鹽水干預(yù)組(NS+NS)，GnRH-a注射+雌二醇干預(yù)組（GnRH-a+E2），GnRH-a注射+黑升麻制劑干預(yù)組（

27、GnRH-a+ICR）。陰道涂片方法鑒定造模成功后，給予相應(yīng)藥物干預(yù)28d。干預(yù)結(jié)束后處死大鼠，以雙能X線骨密度掃描儀檢測(cè)大鼠股骨遠(yuǎn)端的骨密度(BMD)。將大鼠脛骨組織脫鈣，制作切片，HE染色觀察各組大鼠脛骨病理形態(tài)學(xué)改變;通過(guò)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)分析比較各組大鼠模型脛骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)，如骨小梁相對(duì)體積(TBV)、骨小梁厚度(TbTh)、骨小梁數(shù)量(TbN)和骨小梁分離度(TbSp)。
　　結(jié)果:(1) GnRH-a+NS組股

28、骨遠(yuǎn)端的骨密度(BMD)水平明顯低于NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.01)，而GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組較NS+NS組略低，三組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)顯微鏡下觀察各組大鼠模型脛骨病理學(xué)改變顯示:NS+NS組脛骨骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)骨小梁變細(xì)、斷裂等現(xiàn)象，拱形結(jié)構(gòu)正常，GnRH-a+NS組部分骨小梁變細(xì)、拱形結(jié)構(gòu)消失，但骨小梁尚無(wú)明顯斷裂，GnRH-a+E2及GnR

29、H-a+ICR兩組大鼠脛骨骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)骨小梁變細(xì)、斷裂，拱形結(jié)構(gòu)正常。(3) GnRH-a+NS組骨小梁相對(duì)體積(TBV)明顯低于NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01);而NS+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(4)四組大鼠模型骨小梁厚度(TbTh)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與NS+NS組相比，Gn

30、RH-a+NS，GnRH-a+E2，GnRH-a+ICR組TbTh有下降趨勢(shì);而GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組略高于GnRH-a+NS，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(5)與NS+NS組相比，GnRH-a+NS，GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組骨小梁數(shù)量(TbN)均明顯降低(P＜0.05);GnRH-a+E2及GnRH-a+ICR組較GnRH-a+NS略有上升趨勢(shì)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，三組之間的差異無(wú)