LRRC4多抗制備及在構(gòu)建不同分化階段腦膠質(zhì)瘤差異表達(dá)譜中的應(yīng)用.pdf

1、LRRC4(leucine-rich repeats containing 4)是我室克隆的一個富亮氨酸重復(fù)(leucine-rich repeats，LRR)超家族新成員，定位于染色體7q31-32。前期研究工作表明LRRC4在正常人腦組織中相對特異高表達(dá)，而在80％原發(fā)性腦瘤中表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，尤其是腦膠質(zhì)瘤，提示該基因?qū)τ谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)正常功能的維持起重要作用，是一個新的候選抑瘤基因。 為進(jìn)一步研究LRRC4在胚胎各器官組

2、織中的表達(dá)譜及在不同分化階段腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異，本研究制備了抗LRRC4編碼蛋白的多克隆抗體，以期為后續(xù)的研究工作提供有利的工具。首先運(yùn)用DSGenel.1軟件分析LRRC4編碼蛋白的親水性、抗原性及跨膜結(jié)構(gòu)域，避開跨膜結(jié)構(gòu)域，選取親水性及抗原性均好的蛋白序列用以構(gòu)建融合表達(dá)載體，在E．coli JMl09中IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)。實驗中發(fā)現(xiàn)該融合蛋白主要以包涵體形式存在，應(yīng)用洗滌純化的包涵體蛋白免疫新西蘭兔后收集抗血清，EL

3、ISA檢測其效價為1:10<'8>以上?？寡褰?jīng)純化后去除了抗GST蛋白及菌體蛋白的成分，效價高、特異性好，能以1:2000稀釋用于Western blot及免疫組化實驗。應(yīng)用自制的抗體通過Western blot及免疫組化構(gòu)建了LRRC4在胚胎各器官組織中的表達(dá)譜，進(jìn)一步證實了LRRC4為腦組織相對特異性表達(dá)基因。隨后通過免疫組化檢測LRRC4在37例腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LRRC4在12例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅰ級中表達(dá)下調(diào)，在14

4、例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ級中表達(dá)下調(diào)或缺失(10/14表達(dá)下調(diào)，4/14表達(dá)缺失)，在11例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅲ級中表達(dá)缺失。從正常腦組織及星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的免疫組化結(jié)果中分別計數(shù)10000個細(xì)胞，同時計數(shù)相應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)，運(yùn)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示：LRRC4的表達(dá)在正常腦組織與各級腦膠質(zhì)瘤中有顯著差異(P<0.001)；在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤I級與膠質(zhì)瘤其它各級中亦有顯著差異(P<0.01)；而在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ、Ⅲ

5、級之間沒有差異(P>0.05)。由此表明LRRC4的表達(dá)水平與膠質(zhì)細(xì)胞的分化程度及腦膠質(zhì)瘤的病理分級密切相關(guān)。 LRRC4作為一個新的腦瘤候選抑瘤基因，在不同類型的腦瘤中其作用模式可能并不相同。在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，它與瘤體的分化程度密切相關(guān)，隨著膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度的增高而表達(dá)下調(diào)甚至缺失，因而可能是一個膠質(zhì)細(xì)胞分化決定基因。因此，進(jìn)一步研究LRRC4在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失的機(jī)制及在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用對今后腦膠質(zhì)