IL-17基因轉染小鼠結腸癌細胞C26-IL-17的建立及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、目的:結腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，主要好發(fā)于40到50歲年齡組，發(fā)病率居胃腸道腫瘤的第三位，尤其在發(fā)達國家的發(fā)病率和死亡率極高。隨著我國人民生活水平的提高，飲食結構發(fā)生了很大變化，致使結腸癌的發(fā)病率也日趨增高。目前結腸癌的發(fā)病機制尚不清楚，是提高結腸癌治療效果的一個阻礙，因此本論文將結腸癌作為研究對象。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有很多種，如化學治療、物理治療、手術治療等，但是欲進一步改善患者的預后，還需尋找新的治療方法。腫瘤基因治療是

2、一種新的腫瘤治療方法，即把外源基因導入某種細胞，進而將該細胞接種到荷瘤個體中，通過不斷合成外源基因編碼的蛋白而在體內發(fā)揮相應的功能，最終達到抑制甚至清除腫瘤細胞的目的。腫瘤基因治療的目的基因包括細胞因子、抗癌基因、腫瘤藥物相關基因等。細胞因子作為一種具有重要免疫調節(jié)功能的小分子蛋白質，在腫瘤基因治療中具有重要地位，目前，已有多種細胞因子作為候選者進行了研究，其中IL-17作為Th17細胞的特征性細胞因子引起了我們的興趣。細胞因子IL-1

3、7是輔助性T淋巴細胞亞群(Th17)所分泌的一種細胞因子，在炎癥性疾病及自身免疫性疾病中起重要的作用，可以促進前炎癥因子的釋放，屬于一種促炎細胞因子。目前的研究資料顯示，IL-17在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是IL-17發(fā)揮抗腫瘤作用還是促腫瘤作用還存在爭議。因此，本論文擬建立穩(wěn)定轉染IL-17基因的小鼠結腸癌細胞C26，并建立動物模型，對IL-17在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行研究。
　　方法:
　　1.構建穩(wěn)轉C26

4、/pcDNA3.1和C26/IL-17細胞株并進行鑒定體外培養(yǎng)小鼠C26細胞，采用脂質體轉染的方法將攜帶IL-17基因的pcDNA3.1載體轉染小鼠結腸癌細胞C26，同時將pcDNA3.1空載體轉染C26細胞作為對照組細胞，經(jīng)G418篩選和有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達IL-17蛋白的C26細胞(C26/IL-17)。普通PCR法鑒定C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細胞中IL-17基因的表達，免疫熒光法鑒定三種細胞中IL

5、-17蛋白的表達。
　　2.劃痕修復實驗檢測細胞的遷移能力在24孔板中培養(yǎng)C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17細胞，當細胞生長達到80％到90％融合度時，用10μl的槍頭劃痕，用PBS洗去漂浮的細胞，然后再加入4％FCS完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在0h、24h分別在倒置顯微鏡下觀察并拍照，檢測劃痕寬度的變化。遷移率=（劃痕初始寬度—目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。
　　3.檢測細胞體外增殖能力MTS

6、法檢測C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細胞體外增殖的情況，并繪制增殖曲線。
　　4.構建荷瘤小鼠動物模型將C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細胞分別接種于小鼠背部皮下，每組20只，雌雄各半，觀察三組荷瘤小鼠體內腫瘤大小生長情況、小鼠生存期變化情況。
　　5.荷瘤小鼠脾細胞增殖情況檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，利用密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，采用MTS法檢測

7、各組小鼠脾細胞增殖反應，并繪制增殖曲線。
　　6.荷瘤小鼠脾NK細胞殺傷活性檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，采用MTS法檢測各組小鼠脾NK細胞殺傷活性（效靶比分別為40∶1，20∶1，10∶1）。
　　7.荷瘤小鼠脾細胞中Th1，Th2，Th17，Treg細胞特征性因子的表達情況檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，Real-Tim

8、e PCR法檢測小鼠脾淋巴細胞中Th1、Th2、Th17、Treg細胞特征性細胞因子和/或轉錄因子的表達。
　　8.荷瘤小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)增殖情況檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠腫瘤組織，過濾法和密度梯度離心法分離TIL，采用MTS法檢測各組小鼠TIL的增殖反應情況，并繪制增殖曲線。
　　9.小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞種類鑒定Real-Time PCR法檢測各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞中M1特征性細胞因子

9、IL-10和M2特征性細胞因子IL-12的表達。
　　結果:
　　1.構建穩(wěn)轉細胞株以pcDNA3.1質粒為載體將IL-17基因成功轉染至小鼠結腸癌細胞，建立高表達IL-17的細胞株C26/IL-17。顯微鏡下觀察證實三種細胞形態(tài)沒有明顯變化;普通PCR結果顯示C26/IL-17細胞有IL-17基因的高表達，其他兩種細胞中僅見IL-17的微弱表達;免疫熒光檢測顯示C26/IL-17細胞有IL-17蛋白的表達，而C26、C26

10、/pcDNA3.1細胞未見IL-17蛋白的表達。
　　2.劃痕修復實驗檢測細胞的遷移能力劃痕修復實驗檢測結果顯示C26/IL-17較C26、C26/pcDNA3.1細胞遷移能力增強（P＜0.05）。
　　3.MTS法檢測三種細胞的體外增殖情況結果顯示C26/IL-17較C26、C26/pcDNA3.1細胞增殖能力明顯降低(P＜0.05)。
　　4.構建小鼠荷瘤動物模型將C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-1

11、7三種細胞分別接種于小鼠背部皮下后，第七天可以摸到皮下腫瘤，從第十四天開始，每隔一天測量小鼠腫瘤大小。結果顯示，接種C26/IL-17細胞的小鼠的移植瘤體積明顯小于接種C26和C26/pcDNA3.1細胞的小鼠移植瘤體積(P＜0.05);接種C26和C26/pcDNA3.1細胞的小鼠移植瘤體積間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。并且接種C26/IL-17細胞的雄性小鼠移植瘤明顯小于雌性小鼠移植瘤體積(P＜0.05)，而接種C26、C26/p

12、cDNA3.1細胞的雌雄小鼠移植瘤大小之間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。生存期結果顯示各組小鼠生存期之間均無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　5.荷瘤小鼠脾細胞增殖情況檢測MTS法檢測各組小鼠脾細胞增殖反應結果顯示性別因素對荷瘤小鼠脾細胞的增殖無影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較顯示接種C26/IL-17細胞的小鼠脾細胞較接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾細胞增殖能力強（P＜0.05），與正常小鼠脾細胞增殖能

13、力比較無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾細胞增殖能力較正常小鼠脾細胞增殖能力降低（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾細胞增殖能力無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　6.荷瘤小鼠脾NK細胞殺傷活性檢測NK細胞殺傷活性檢測結果顯示性別因素對荷瘤小鼠脾NK細胞殺傷活性無影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較結果顯示在效靶比為40∶1和20∶1時，接種三種細胞的小

14、鼠NK殺傷率較正常小鼠均降低（P＜0.05）;在效靶比40∶1時，接種C26/IL-17細胞比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠的脾淋巴細胞的NK殺傷率明顯增強(P＜0.05);效靶比10∶1時，各組之間沒有明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;在效靶比40∶1、20∶1和10∶1時，接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾NK細胞殺傷率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　7.荷瘤小鼠脾細胞中Th1，Th2，Th1

15、7，Treg細胞特征性因子的表達情況檢測Real-Time PCR法檢測結果顯示，性別因素對此處結果無影響。接種C26/IL-17細胞的小鼠脾淋巴細胞較接種C26、C26/pcDNA3.1的表達更高水平的IFN-γ(Th1特征性細胞因子)、IL-4(Th2特征性細胞因子)、GATA-3(Th2特征性轉錄因子)、ROR-γt(Th17特征性轉錄因子)、IL-10（Treg特征性細胞因子）mRNA(P＜0.05);接種C26、C26/pcD

16、NA3.1細胞的小鼠脾淋巴細胞表達IFN-γ、IL-4、GATA-3、ROR-γt、IL-10 mRNA的水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　8.荷瘤小鼠腫瘤浸潤的淋巴細胞(TIL)增殖情況檢測MTS法檢測各組荷瘤小鼠TIL的增殖反應結果顯示，性別因素對TIL增殖能力無影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較顯示接種C26/IL-17細胞的小鼠TIL較接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠TIL增殖能力強(P＜0.05);

17、接種三種細胞的小鼠TIL增殖能力較正常組小鼠均降低(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠TIL增殖能力無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　9.小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞種類鑒定Real-Time PCR法檢測各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞中IL-10和IL-12mRNA表達結果顯示，性別因素對本指標無影響，IL-10和IL-12mRNA表達在各組荷瘤小鼠之間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　結論:

18、>　　1.成功構建穩(wěn)定轉染IL-17基因小鼠結腸癌細胞株(C26/IL-17)。轉染IL-17基因對細胞形態(tài)沒有明顯影響，可以使細胞體外增殖減慢，細胞遷移能力增強。
　　2.成功建立了小鼠結腸癌模型，轉染IL-17基因可以抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，增強小鼠脾細胞增殖能力和NK細胞殺傷活性，可使小鼠脾細胞中Th1、Th2、Th17、Treg細胞分泌特征性因子增多。促進小鼠腫瘤浸潤的淋巴細胞增殖。
　　3.IL-17高表達對雄性小