AQP8在人羊膜上皮細(xì)胞WISH株中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：羊水膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)是羊水吸收的重要調(diào)節(jié)方式，對羊水量的平衡起了重要作用，但其細(xì)胞和分子機(jī)制還不清楚。通過研究人羊膜上皮細(xì)胞AQP8的表達(dá)和調(diào)控，探討羊水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為臨床羊水量異常尋找治療策略提供理論依據(jù)。 方法：(1)培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞WISH株。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，對照組予以正常培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組分為3組：低滲組、高滲透組、環(huán)磷酸腺苷(cycliadenosinemonophosphate,cAMP)組。低滲透組將

2、細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至80％，60％兩組，繼續(xù)培養(yǎng)羊膜上皮細(xì)胞；高滲組將細(xì)胞培養(yǎng)液濃縮至120％，140％兩組，繼續(xù)培養(yǎng)羊膜上皮細(xì)胞；cAMP組將8-Br-cAMP加入培養(yǎng)液，使其在細(xì)胞培養(yǎng)液中濃度分別為10μM、20μM、40μM、100μM、200μM、400μM，分別培養(yǎng)羊膜上皮細(xì)胞。各組分別在培養(yǎng)2h、4h、8h、16h、24h和48h時(shí)取樣。各組重復(fù)培養(yǎng)6瓶。(2)采用Westernblot技術(shù)定量檢測WISH細(xì)胞AQP8蛋白表達(dá)。

3、(3)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)半定量檢測WISH細(xì)胞AQP8mRNA的表達(dá)。(4)采用免疫熒光組織化學(xué)方法原位檢測WISH細(xì)胞上AOP8的分布。 結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組和對照組WISH細(xì)胞均能表達(dá)較低水平的AQP-8mRNA和蛋白，WISH細(xì)胞AQP8蛋白以糖基化形式存在。WISH細(xì)胞AQP8蛋白主要定位在細(xì)胞內(nèi)，而在細(xì)胞膜的表達(dá)卻相對較少。(2)各低滲組細(xì)胞AQP8mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0

4、．05)，各高滲組細(xì)胞AQP8mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯低于對照組(P<0．05)；在不同滲透狀態(tài)下的不同培養(yǎng)時(shí)間，AQP8mRNA和蛋白表達(dá)隨低滲程度的增加而增加，隨高滲程度的增加而降低(P<0．05)。熒光顯微鏡觀測低滲液培養(yǎng)的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯減弱；高滲液培養(yǎng)的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的熒光明顯減弱而細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯增強(qiáng)(3)8-Br-cAMP孵育的細(xì)胞隨著其濃度的升高AQP8蛋白水平明顯升高(P<0．05)。

5、培養(yǎng)液中8-Br-cAMP為20μM～200gM時(shí)，其蛋白水平增加2～5倍，在200μM時(shí)達(dá)到峰值。AQP8蛋白水平在8h就開始增加，在24h達(dá)到峰值，增加約5倍。8-Br-cAMP孵育的細(xì)胞隨著其濃度的升高AQP8mRNA水平明顯升高(P<0．05)。培養(yǎng)液中8-Br-cAMP為20μM～200μM時(shí)，其mRNA水平增加2～5倍，在200μM時(shí)達(dá)到峰值。AQP8mRNA水平在2h就開始增加，在8h達(dá)到峰值，16h開始下降，24h降到8

6、-Br-cAMP孵育前的水平。8-Br-cAMP孵育的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的熒光減弱而細(xì)胞膜的熒光明顯增強(qiáng)。 結(jié)論：(1)WISH細(xì)胞有AQP8mRNA和蛋白表達(dá)，其表達(dá)水平與文獻(xiàn)報(bào)道的人羊膜上皮細(xì)胞相似。表明WISH細(xì)胞可以作為研究羊膜AQP8水轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控機(jī)制的細(xì)胞模型。(2)隨著羊水滲透壓的改變，WISH細(xì)胞的AQP8蛋白基因表達(dá)及分布發(fā)生相應(yīng)的改變，從而改變細(xì)胞對水的通透性，調(diào)節(jié)羊水重吸收。(3)8-Bt-cAMP刺激WISH細(xì)胞