嚴(yán)重?zé)齻笫竽c淋巴循環(huán)細(xì)菌、炎癥因子及T細(xì)胞亞群的變化.pdf

1、目的：嚴(yán)重?zé)齻麑?duì)機(jī)體是一個(gè)強(qiáng)烈的刺激，可以引起包括腸粘膜損害的全身反應(yīng)，腸道屏障障礙引起細(xì)菌移位，形成內(nèi)源性感染，進(jìn)一步可造成遠(yuǎn)位器官功能的損害。細(xì)菌移位的途徑有淋巴途徑、血液途徑、跨腸壁途徑。可以把細(xì)菌移位的過程分為三個(gè)階段：1.腸壁屏障(粘膜上皮及腸相關(guān)淋巴組織)2.腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node,MLN)/肝臟3.血液循環(huán)及遠(yuǎn)位臟器。第二階段是內(nèi)源性感染能否發(fā)生的關(guān)鍵一環(huán)，其免疫狀態(tài)對(duì)是否造成全身感染具有

2、重要的意義。 以往大多數(shù)實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)血液循環(huán)或者各個(gè)臟器來研究細(xì)菌移位對(duì)機(jī)體的影響，而直接對(duì)淋巴途徑研究的報(bào)道相對(duì)較少。由于淋巴管解剖操作難度較大，以往對(duì)淋巴的研究主要集中于較粗的胸導(dǎo)管，而直接研究腸淋巴的甚少。胸導(dǎo)管收集了腸干、腰干的淋巴，其變化不能為腸源性感染提供直接的證據(jù)，這可能是造成許多研究具有爭(zhēng)議和矛盾的原因之一。 本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)MLN及腸淋巴(mesenteric lymph nuid，MLF)的細(xì)菌/內(nèi)毒素

3、、炎癥介質(zhì)及免疫狀態(tài)的檢測(cè)，與肝臟及肝后水平進(jìn)行比較，確定腸淋巴(mesenteric lymph，ML)在細(xì)菌移位時(shí)的狀態(tài)和作用。 主要研究?jī)?nèi)容：本研究擬尋找建立理想淋巴管瘺動(dòng)物模型的方法，研究MLF的動(dòng)態(tài)變化，比較嚴(yán)重?zé)齻笫驧LF和肝靜脈細(xì)菌、內(nèi)毒素的變化特點(diǎn)：比較MLN、MLF、肝臟、血液內(nèi)炎癥介質(zhì)(致炎因子IL-18，抗炎因子IL-10、晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白(High mobility group box-1 p

4、rotein,HMGB-1))的變化，MLNT細(xì)胞亞群CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+的變化，研究腸淋巴與細(xì)菌移位、腸源性感染的關(guān)系。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性Wistar大鼠。利用顯微外科技術(shù)采用不同的手術(shù)入路建立淋巴管瘺模型，引流淋巴液，采集淋巴液標(biāo)本；下腔靜脈插管，并使管道末端朝向肝靜脈，采集以肝靜脈血為主的血液標(biāo)本；將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：燙傷組(Scald)、假燙傷組(Sham)。致傷后2小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)

5、采集標(biāo)本：MLF、血液，MLN，肝臟，采集標(biāo)本在4℃冰生理鹽水中漂洗污血。 利用CM-Dil標(biāo)記法和細(xì)菌培養(yǎng)法，分別檢測(cè)總細(xì)菌和活菌移位情況；利用定量顯色基質(zhì)鱉試驗(yàn)法測(cè)量?jī)?nèi)毒素的水平，觀察嚴(yán)重?zé)齻蠹?xì)菌移位的變化特點(diǎn)。 分離留取血清、淋巴液，將組織勻漿，離心，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清、組織內(nèi)IL-18，IL-10水平，用Western Blotting法檢測(cè)HMGB-1水平，觀察炎癥介質(zhì)的變化規(guī)律。

6、 電鏡觀察腸系膜淋巴結(jié)的超微結(jié)構(gòu)和凋亡情況，流式細(xì)胞儀FITC-AnnexinV/PI染法檢測(cè)嚴(yán)重?zé)齻笫蟮牧馨徒Y(jié)細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，觀察嚴(yán)重?zé)齻麑?duì)腸道引流淋巴結(jié)免疫狀態(tài)的影響。 用Spss for windows 13.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有結(jié)果以(x±s)表示。 結(jié)果： 1．利用顯微外科技術(shù)插管成功率82.5﹪，正中切口和斜切口對(duì)制作腸淋巴瘺模型制沒有顯著差異，斜切

7、口可以大大縮短胸導(dǎo)管淋巴瘺的操作時(shí)間；24小時(shí)內(nèi)，腸系膜淋巴每小時(shí)平均流量?jī)煞N方法沒有顯著差異。 2．在燒傷大鼠的各個(gè)標(biāo)本中都檢測(cè)到了熒光標(biāo)記細(xì)菌，傷后2小時(shí)，各個(gè)組織內(nèi)的細(xì)菌開始明顯增高，傷后24小時(shí)達(dá)到高峰，傷后72小時(shí)開始下降，但是活菌檢出率增高。肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、淋巴內(nèi)的內(nèi)毒素傷后2小時(shí)就達(dá)到高峰，肝組織內(nèi)毒素濃度相對(duì)較高，血液內(nèi)毒素水平升高沒有組織內(nèi)毒素的劇烈。淋巴內(nèi)毒素的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血液的含量，最高10余倍。但是淋

8、巴管的攜帶量0.029±0.010Eu/min，小于血液的攜帶量0.815±0.295Eu/min(p<0.05)。 3．炎癥介質(zhì)的變化： 燒傷組后IL-18水平從傷后2小時(shí)即開始明顯升高(p<0.05)，在24小時(shí)達(dá)到高峰，MINs的IL-18水平(57.87±1.12pg/ml)顯著高于肝的(52.42±0.95 pg/ml)(p<0.05)。72小時(shí)開始下降，但是肝臟下降幅度比較小，仍處于較高水平。 燒傷后

9、IL-lO水平開始略有升高(p>0.05)，傷后24達(dá)到高峰，傷后72小時(shí)略有下降，肝臟從24小時(shí)到72小時(shí)都維持在一個(gè)比較高的水平(p<0.05)。傷后24小時(shí)淋巴液內(nèi)IL-10的水平(16.20±1。93 pg/ml)高于血液內(nèi)的(14.90±2.02 pg/ml)(D>0.05)。傷后72小時(shí)IL-18/IL-10顯著降低。 傷后24～72小時(shí)HMGB-1開始表達(dá)，并維持在較高水平，血液的HMGB-1水平比較低。MLN的表

10、達(dá)量最高，略高于肝臟(p>0.05)。 4．腸系膜淋巴的凋亡情況：假燙傷組凋亡率為8.6±0.57﹪，燒傷組傷后2小時(shí)為16.5±0.75﹪，24小時(shí)組為23.0±0.57﹪，72小時(shí)為27.5+1.02﹪。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，嚴(yán)重?zé)齻?h,24小時(shí)，72小時(shí)的腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)胞凋亡率均升高，與假燙傷組比較有顯著差異(p<0.05)。 5．淋巴結(jié)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值變化：嚴(yán)重?zé)齻驝D4+

11、的比例明顯下降，傷后72小時(shí)最低(49.8±0.84﹪)。各組CD8+的比例在傷后2、24和72小時(shí)，都有不同程度的升高(p<0.05)。各組CD4+/CD8+比值比都有明顯下降，燒傷組傷后72小時(shí)最低1.96±0.04． 結(jié)論： 1．利用顯微外科技術(shù)采用斜切口是制作淋巴瘺模型的理想方法，手術(shù)入路對(duì)腸淋巴瘺的制作沒有顯著影響。 2．CM-Dil標(biāo)記細(xì)菌能夠比較全面的反映細(xì)菌移位的情況，絕大多數(shù)移位的細(xì)菌能夠被腸系

12、膜淋巴結(jié)等免疫器官殺死。淋巴液內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素的水平比肝靜脈血的高，但是攜帶量比肝靜脈血的低，因此淋巴途徑是細(xì)菌移位的重要途徑。 3．燒傷后高濃度的微生物、內(nèi)毒素移位到MLN刺激MIN內(nèi)的淋巴細(xì)胞，分泌了較多的IL-18、IL-10、HMGBl，IL-18在腸淋巴的早期炎癥反應(yīng)中起重要作用，而HMGB維持和延續(xù)了炎癥反應(yīng)，晚期IL-18/IL-10明顯下降，提示Th1/Th2平衡處于Th2狀態(tài)。 4.嚴(yán)重?zé)齻蟠笫竽c系膜淋