隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44表達(dá)研究.pdf

1、
　　 新生隱球菌是一種嚴(yán)重危害人類健康的醫(yī)學(xué)真菌，隱球菌病發(fā)病率逐年增加，其中90％侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起致命性的腦膜腦炎。新生隱球菌侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制和治療的研究受到高度重視。
　　 隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前提是必須通過血腦屏障。目前，國內(nèi)外學(xué)者圍繞隱球菌與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用方面做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了隱球菌通過胞吞胞吐等方式穿越腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 最新的研究顯示，在隱球菌感染腦血管內(nèi)皮細(xì)胞過程中

2、，菌體莢膜透明質(zhì)酸HA與宿主CD44相互作用，促進(jìn)隱球菌侵襲宿主細(xì)胞和細(xì)胞骨架重組。易于菌體穿越腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。CD44在隱球菌感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，CD44是分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，屬于未分類的粘附分子。CD44作為細(xì)胞表面的黏著性受體，與許多疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸都有密切的關(guān)系，甚至能成為多種疾病治療的靶點(diǎn)。
　　 目前，國內(nèi)外學(xué)者研究隱球菌穿越血腦屏障感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制主要集中在細(xì)胞

3、水平上，在動物模型上的研究報道較少。
　　 本研究組已經(jīng)成功建立隱球菌腦膜炎小鼠模型。在此基礎(chǔ)上，已經(jīng)開展了多項關(guān)于隱球菌腦膜炎的發(fā)病機(jī)制的課題研究，分析了新生隱球菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染動物模型腦組織含水量的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)AQP4蛋白在調(diào)節(jié)隱球菌腦膜炎腦內(nèi)水液平衡中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步研究探索隱球菌腦膜炎的發(fā)病機(jī)制打下良好的基礎(chǔ)。我們擬在動物模型上研究隱球菌與小鼠作用前后CD44的表達(dá)變化，闡明CD44是隱球菌腦膜炎發(fā)生的重要分子

4、。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在分子水平上研究隱球菌與宿主的相互作用已經(jīng)非常成熟。我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、Western-blotting技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44表達(dá)，闡明小鼠腦組織CD44表達(dá)與隱球菌腦膜炎發(fā)病的相互聯(lián)系，說明CD44在隱球菌腦膜炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。探索和闡明隱球菌腦膜炎的可能的發(fā)病機(jī)制，為本病的預(yù)防和治療指明新的方向。
　　 目的：
　　 1、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、West

5、ern blotting和免疫組化技術(shù)測定隱球菌腦膜炎小鼠腦組織中CD44表達(dá)；
　　 2、闡明CD44與隱球菌腦膜炎發(fā)生的關(guān)系，探索隱球菌腦膜炎可能的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 第一部分：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織標(biāo)本從-70℃冰箱取出備用。
　　 2、將各組組織轉(zhuǎn)移至12×55mmm試管中，勻漿后，經(jīng)異丙醇，75％乙醇，20ulDEPC處理水處理，抽提組織RNA。
　　 3

6、、將經(jīng)過稀釋后的RNA樣本，加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV1ul，oligo(d T0.5 ul，dNTPs0.5ul，5×逆轉(zhuǎn)錄buffer4ul，DEPC處理水10ul反應(yīng)，制備逆轉(zhuǎn)錄cDNA。
　　 4、將制備好cDNA2ul加入SYBRGreen Mix32.5ul，上游引物F0.5ul，下游引物R0.5ul，ddH2O水14.5ul，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　 第二部分：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織標(biāo)本從-70

7、℃冰箱取出備用。
　　 2、將稱取各樣本冰浴條件下勻漿；13200rpm離心，取上清液，-80℃保存。
　　 3、樣品采用10倍稀釋，求得在20μl總體積中的樣品體積，每個樣品上樣量為40μg。
　　 4、將分裝好的樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉、然后加入一抗和二抗作用、ECL顯色后，放入定影液顯影定影。檢測腦CD44的表達(dá)。
　　 第三部分：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織標(biāo)本及正常

8、小鼠腦組織從-70℃冰箱取出備用。
　　 2、免疫組化染色：將各組標(biāo)本取出制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水，加入一抗和二抗以及顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色。
　　 3、封片后鏡下觀察切片結(jié)果，最后拍攝照片。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44的mRNA在12h的mRNA表達(dá)水平與對照組，48h,4d,7d組相比較升高，有統(tǒng)計學(xué)意義。(p＜0.05)，其它時間點(diǎn)小鼠腦組織mRNA表達(dá)兩兩

9、比較沒有顯著變化。
　　 第二部分：
　　 隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44試驗(yàn)組各時間點(diǎn)蛋白表達(dá)與對照組相比無顯著變化(p＞0.05)，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 第三部分：
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明對照組小鼠腦組織CD44均勻分布在腦細(xì)胞膜上。實(shí)驗(yàn)組中隱球菌作用小鼠6h,12h后，小鼠腦組織CD44的分布沒有明顯變化，作用24h后，隱球菌誘導(dǎo)腦組織CD44向腦組織的一側(cè)移行，作用48h,72h后，CD44的分布發(fā)

10、生了明顯變化，在隱球菌腦膜炎腦膜側(cè)的腦組織分布大量的CD44，而在腦實(shí)質(zhì)側(cè)CD44的分布明顯減少。更重要的是在病灶周圍的腦組織CD44分布也觀察到一側(cè)增加，另一側(cè)分布減少。
　　 結(jié)論：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織試驗(yàn)組CD44的mRNA水平表達(dá)出現(xiàn)短暫性增高。隱球菌腦膜炎小鼠試驗(yàn)組CD44蛋白表達(dá)與對照組沒有發(fā)生顯著的變化。
　　 2、隱球菌侵入小鼠大腦后，隱球菌誘導(dǎo)CD44向腦組織的一側(cè)移行，向腦膜方向