胃癌組織芯片中Argonaute家族蛋白表達(dá)研究.pdf

1、研究背景及目的： 胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其確切的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚。惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)是一個(gè)復(fù)雜過程，了解該過程的生物學(xué)基礎(chǔ)并探索有關(guān)診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記均需要對(duì)成百上千例腫瘤進(jìn)行大樣本研究。組織芯片又稱組織微陣列，是將數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)小的組織片整齊地排列在某一載體上(通常是載玻片)而成的微縮組織切片，可同時(shí)研究大量組織以及不同因子的表達(dá)。RNA干擾是一種雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，在該現(xiàn)

2、象中Argonaute蛋白作為一個(gè)高度保守的家族與多種生物的RNA干擾密切相關(guān)，是組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的核心元件。Argonaute蛋白選擇性地與miRNA(microRNA)或siRNA結(jié)合，其PIWI盒子與Dicer的RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域直接相互作用，PIWI與Dicer之間的相互作用可能會(huì)促進(jìn)miRNA/siRNA的釋放。目前有研究表明miRNA與多種腫瘤的發(fā)生存在著密切關(guān)系，miRNA既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基

3、因的活性；也可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。Argonaute蛋白選擇性地與miRNA和siRNA結(jié)合，并影響其表達(dá)，因此Argonaute蛋白極可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究將制備胃癌組織芯片，利用其高通量?jī)?yōu)勢(shì)，檢測(cè)胃癌組織中microRNA相關(guān)蛋白——Argonaute家族系列蛋白表達(dá)情況，研究其表達(dá)特點(diǎn)，分析與胃癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 對(duì)象與方法： 1、材料：200例胃腺癌組織標(biāo)本和100例胃炎癥黏膜組織取自生物

4、芯片上海國家工程研究中心組織庫國家863項(xiàng)目協(xié)作醫(yī)院新鮮手術(shù)切除標(biāo)本及存檔標(biāo)本，全部病例術(shù)前均未作化療或放療。胃腺癌患者中男性132例，女性68例，年齡28～81歲。胃炎癥黏膜患者中男性68例，女性32例，年齡24～71歲。所有組織標(biāo)本用10％中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋備用。 2、試劑：Argonaute1、Argonaute2，Argonaute3和Argonaute4單克隆抗體均購自上海芯超生物科技有限公司。Piw

5、il1、Piwil2、Piwil3和Piwil4單克隆抗體均購自上海芯超生物科技有限公司。 3、組織芯片制備：組織芯片由生物芯片上海國家工程研究中心制備。首先對(duì)每一個(gè)供體蠟塊進(jìn)行切片和HE染色。顯微鏡下對(duì)所需穿取的目標(biāo)組織進(jìn)行定位，選取癌、炎癥黏膜共計(jì)300個(gè)位點(diǎn)，并利用組織芯片制作儀(BeecherInstruments．Inc)制成組織芯片，以5um的厚度連續(xù)切片，所得的組織芯片的每個(gè)點(diǎn)都經(jīng)過病理診斷。 4、觀察指標(biāo)

6、：采用二步法進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)胃癌組織和胃炎癥黏膜組織中人類Argonaute家族蛋白—Argonaute亞家族(Argonautel、Argonaute2、Argonaute3、Argonaute4)及PIWI亞家族(Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4)表達(dá)情況。所有8個(gè)蛋白陽性染色均為細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，觀察5個(gè)以上高倍視野，計(jì)數(shù)不少于1000個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。取陽性細(xì)胞百分比的平均值(陽性積分)為結(jié)果

7、并統(tǒng)計(jì)。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用PEMS3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組織間Argonaute1、Argonaute2，Argonaute3、Argonaute4、Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4蛋白表達(dá)相關(guān)采用多樣本比較及兩兩比較的秩和檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)陽性率兩兩比較采用wilcoxon秩和檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1、Argonaute亞家族蛋白表達(dá)：胃癌組織中Argonaute1、Argonaute

8、2、Argonaute3和Argonaute4蛋白表達(dá)明顯高于胃炎癥黏膜組織，差異具有顯著性(均P＜0.05)。在胃癌組織中Argonaute1、Argonaute2、Argonaute3和Argonaute4蛋白兩兩間表達(dá)均存在相關(guān)性(P＜0.01)。 2、Argonaute亞家族蛋白表達(dá)與胃癌臨床分期關(guān)系：胃癌組織(Ⅰ—Ⅱ期)中Argonaute1、Argonaute2，Argonaute3和Argonaute4蛋白表達(dá)明顯

9、高于胃炎癥黏膜組織(P＜0.05)。Argonaute2、Argonaute3，Argonaute4蛋白在胃癌(Ⅰ—Ⅱ期)和胃癌(Ⅲ—Ⅳ期)中的表達(dá)差異有顯著性(P＜0.05)；Argonaute1蛋白在在胃癌(Ⅰ—Ⅱ期)和胃癌(Ⅲ—Ⅳ期)中的表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05)。 3、PIWI亞家族蛋白表達(dá)：胃癌組織中Piwill蛋白表達(dá)高于胃炎癥黏膜組織(P＜0.05)；Piwil2、Piwil3和Piwil4在胃癌組織和胃炎癥

10、組織中的表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05)。 4、PIWI亞家族蛋白表達(dá)與胃癌臨床分期關(guān)系：Piwill蛋白在胃炎癥黏膜組織和胃癌(Ⅰ—Ⅱ期)中表達(dá)差異有顯著性(P＜0.05)；Piwill蛋白在胃癌(Ⅰ—Ⅱ期)和胃癌(Ⅲ—Ⅳ期)中表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論： 1、胃癌的發(fā)生與Argonaute1、Argonaute2，Argonaute3和Argonaute4蛋白過表達(dá)可能有關(guān)。 2、胃癌的