LASS2基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、本研究的目的是通過構(gòu)建人源性LASS2基因的真核表達載體，建立穩(wěn)定過表達LASS2蛋白的HCCLM3細胞株，來研究LASS2基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制。 本研究分三部分進行。 在第一部分中，著重于LASS2基因?qū)CCIJM3肝癌細胞轉(zhuǎn)移影響的研究，分三組實驗進行。 1、LASS2基因在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌中表達情況的檢測： Northern blot結(jié)果顯示，高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系HCCLM3中LASS

2、2基因的表達水平比低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系MHCC97-L要低；對20例臨床肝癌樣本原位癌組織(已轉(zhuǎn)移組10例，未轉(zhuǎn)移組10例)的檢測結(jié)果顯示，已轉(zhuǎn)移組的IASS2基因的表達水平比未轉(zhuǎn)移組低。 2、LASS2基因?qū)CCLM3細胞轉(zhuǎn)移能力影響的體外實驗： 通過構(gòu)建真核表達載體pCMV-HA2-IASS2，并將其轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系HCCLM3，經(jīng)G418篩選，我們建立了穩(wěn)定過表達IASS2基因的HCCIM3細胞系。通過

3、劃痕實驗及體外侵襲實驗，證實了LASs2基因在HCCLM3細胞中過表達后，HCCLM3細胞在遷移、侵襲等轉(zhuǎn)移能力上受到了明顯的抑制。 3、LASS2基因?qū)CCLM3細胞轉(zhuǎn)移能力影響的裸鼠體內(nèi)實驗： 裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果證實，當(dāng)IASS2基因穩(wěn)定過表達時，HCCLM3細胞的轉(zhuǎn)移能力受到抑制。同時，我們采用原位酶譜方法，對裸鼠的肝移植瘤組織進行MMP-2/MMP-9的活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)HASS2基因抑制了HCCLM3細胞MMP

4、-2/MMP-9的激活。 LASS2基因在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌中低表達，在低轉(zhuǎn)移潛能肝癌中高表達；綜合體外及體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果，以及LASS2基因在HCCLM3細胞過表達后，HCCLM3細胞MMP-2/MMP-9在激活方面的變化，這些證實LASS2基因?qū)Ω伟┘毎鸋CCLM3的轉(zhuǎn)移具有顯著地抑制作用；結(jié)合在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)LASS2與V-ATPase的ATP6L亞基相互結(jié)合，提示LASS2基因抑制肝癌細胞HCCLM3轉(zhuǎn)移的機制可

5、能與LASS2蛋白結(jié)合ATP6L亞基后抑制V-ATPase的活性相關(guān)。 在第二部分中，著重于LASS2對V-ATPase泌氫功能影響的研究，分三組實驗進行。 1、LASS2與ATP6L相互結(jié)合的研究： 通過蛋白亞細胞共定位實驗、co-IP(Co-immunoprecipitation，CO-IP)實驗、熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)等

6、實驗，我們確認LASS2與ATP6L可以相互結(jié)合；在蛋白亞細胞共定位實驗中，發(fā)現(xiàn)ATP6L的定位發(fā)生改變。 2、LASS2對ATP6L影響的研究： 熒光淬滅后能量恢復(fù)實驗(Fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAY)實驗結(jié)果證實，LASS2蛋白可以抑制ATP6L蛋白的運動。 3、LASS2對V-ATPase泌氫功能影響的研究： ATP6L的norther

7、n blot檢測結(jié)果顯示，LASS2基因在HCCLM3細胞內(nèi)穩(wěn)定過表達后，ATP6L的表達并未發(fā)生明顯改變，LASS2基因在HCCLM3細胞內(nèi)穩(wěn)定過表達后，ATP6L的表達并未發(fā)生明顯改變，但LASS2組細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時后細胞泌氫較對照組減少，且LASS2組細胞的pHi在NH4<'+>誘導(dǎo)酸化后恢復(fù)受阻；同時，用激光共聚焦顯微鏡對活細胞進行觀測時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞處于對酸過載的反應(yīng)期時，對照組細胞內(nèi)出現(xiàn)ATP6L-GFP蛋白的局部富集，

8、而LASS2組細胞內(nèi)的ATP6L-GFP蛋白未發(fā)生變化。 通過蛋白亞細胞共定位實驗、CO-IP實驗、FRET等實驗，我們確認LASS2與ATP6L可以相互結(jié)合；FRAP實驗結(jié)果證實，LASS2蛋白可以抑制ATP6L蛋白的運動；LASS2組細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時后細胞泌氫較對照組減少，且LASS2組細胞的pHi在NH4<'+>誘導(dǎo)酸化后恢復(fù)受阻；激光共聚焦顯微鏡的觀測結(jié)果顯示，當(dāng)細胞處于對酸過載的反應(yīng)期時，對照組細胞內(nèi)出現(xiàn)ATP6

9、L-GFP蛋白的局部富集，而LASS2組細胞內(nèi)的ATP6L-GFP蛋白未發(fā)生變化。上述結(jié)果證實LASS2基因?qū)-ATPase的泌H<'+>能力具有抑制作用，并提示其作用機制與LASS2蛋白結(jié)合ATP6L亞基并抑制其運動相關(guān)。 在第三部分中，著重于LASS2影響HCCLM3細胞對酸性微環(huán)境應(yīng)答的研究，分三組實驗進行。 1、在酸性微環(huán)境中，LASS2對HCCLM3細胞溶酶體影響的研究： 我們使用吖啶橙染料對活細胞的

10、溶酶體進行染色，使用激光共聚焦顯微鏡對活細胞進行觀測。成像結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基由堿性(pH7.4)變?yōu)樗嵝?pH6.6)時，對照組細胞內(nèi)的溶酶體由核周向細胞邊緣及細胞觸角內(nèi)遷移，而LASS2組細胞內(nèi)溶酶體的位置無改變。 2、在酸性微環(huán)境中，LASS2對HCCLM3細胞MMP-2影響的研究： 當(dāng)LASS2組與對照組細胞分別用不同pH值(pH7.4、pH 7.0、pH 606)的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后，通過對細胞蛋白及無血清細胞培養(yǎng)

11、上清用MMP-2抗體進行western blot檢測，結(jié)果顯示，LASS2基因?qū)毎麅?nèi)的MMP-2合成并無影響，但抑制細胞MMP-2的分泌。而以明膠(A型)為底物的進行Zymographv分析及細胞原位酶譜實驗，結(jié)果顯示LASS2組細胞MMP-2的激活受到了明顯的抑制。當(dāng)細胞外周微環(huán)境向酸性變化時，LASS2依然抑制MMlP-2的分泌與激活。 3、在酸性微環(huán)境中，LASS2對HCCIM3細胞轉(zhuǎn)移影響的研究： 體外腫瘤細胞

12、侵襲實驗、遷移實驗、黏附實驗證實，當(dāng)細胞外周微環(huán)境向酸性變化時，LASS2依然明顯抑制HCCLM3細胞的轉(zhuǎn)移。 上述結(jié)果進一步證實，LASS2蛋白結(jié)合ATP6L亞基后，通過抑制ATP6L在細胞內(nèi)的移動，不僅導(dǎo)致V-ATPase的失活，還導(dǎo)致了腫瘤細胞內(nèi)的溶酶體在酸性微環(huán)境的下無法從胞核周向細胞觸角及細胞膜邊緣遷移，從而導(dǎo)致腫瘤細胞MMP-2的分泌與激活受到明顯的抑制，并造成腫瘤細胞在酸性微環(huán)境下的轉(zhuǎn)移能力無明顯改變。 本