人乳腺癌相關(guān)肽和胰解痙肽在大腸桿菌中的重組表達(dá)、純化及其生物活性研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文人乳腺癌相關(guān)肽和胰解痙肽在大腸桿菌中的重組表達(dá)、純化及其生物活性研究姓名：吳煒申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)（燒傷）指導(dǎo)教師：彭曦20071101第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文得h T F F l 和h T F F 2 成熟肽c D N A 序列，轉(zhuǎn)化至O r i g a m iB ( D E 3 ) 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，和層析、超濾離心純化重組蛋白。克隆至質(zhì)粒p E T 3 2 a 獲得重組載體；雙酶切后優(yōu)化表達(dá)條件獲得最

2、大表達(dá)產(chǎn)量；N i —N T A 親2 ．r h T F F l 和r h T F F 2 的鑒定：通過重組質(zhì)粒測序、S D S —P A G E 和W e s t e r n b l o t 鑒定重組蛋白。3 ．r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白理化性質(zhì)的研究：將純化后的r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白分別置于模擬胃腸道環(huán)境的液體中：①不同濃度的胰蛋白酶，3 7 。c 消化4 h ；②

3、不同濃度的胃蛋白酶，3 7 。C 消化4 h ；③p H 值2 ．0 ．1 2 ．O 的緩沖液中，3 7 。C 孵育5 h 。采用N o n —r e d u c i n g T r i c i n eS D S —P A G E 分析殘余r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白的百分比，觀察在模擬胃腸道環(huán)境中r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白的穩(wěn)定性。4 ．r h T F F l 和r h T

4、 F F 2 融合蛋白體外生物學(xué)活性研究：①采用M T T 法和C C K 一8 法觀察r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白對(duì)M I ( N 一2 8 細(xì)胞增殖活性的影響；②采用M I Ⅲ．2 8細(xì)胞機(jī)械損傷模型，觀察r h T F F l 和r h T F F 2 對(duì)細(xì)胞移行速率的影響。5 ．r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白體內(nèi)生物學(xué)活性研究：采用灌胃無水乙醇和3 0 ％體表面積( t

5、o t a lb o d y s u r f a c ea r e a ，T B S A ) I I I 。燒傷小鼠模型，觀察r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白對(duì)兩種致傷模型小鼠胃粘膜損傷和修復(fù)的影響。結(jié)果：1 ．獲得h T F F l 和h T F F 2 成熟肽c D N A 序列，與G e n b a n k 數(shù)據(jù)庫所收錄的基因序列完全一致，成功構(gòu)建含目的基因的重組載體p E T 3 2 a - h T F

6、 F l 和p E T 3 2 a - h T F F 2 ；在大腸桿菌O r i g a m i B ( D E 3 ) 中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要集中在細(xì)菌胞質(zhì)中，有少量包涵體形成( 小于3 0 ％) 。重組h T F F l 和h T F F 2 融合蛋白產(chǎn)量分別約1 6 9 ．6 m g ／L 和2 4 6 ．5 m g ／L 。2 ．w e s t e r nb l o t 證明重組蛋白具有良好的抗原性和特異性；通過N i —N

7、 T A 親和層析、超濾離心后得到9 5 ％以上純度的重組蛋白。3 ．r h T F F l 融合蛋白在胰酶／蛋白質(zhì)量比為1 ：1 0 0 時(shí)即發(fā)生水解，降解為r h T F F l二聚體的形式，隨著胰蛋白酶的濃度逐漸升高，r h T F F l 二聚體的比例也逐漸下降，至胰酶／蛋白比為1 ：1 時(shí)，r h T F F l 二聚體己全部降解；而r h T F F 2 融合蛋白直至胰酶／蛋白質(zhì)量比為1 ：l 時(shí)，融合蛋白仍有6 5 ．3

8、％殘留。r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白在胃蛋白酶／蛋白質(zhì)量比為1 ：l 時(shí)，經(jīng)過4 h 消化，r h T F F l 和r h T F F 2 融合蛋白殘余量分別為7 3 ．7 ％和5 0 ．7 ％。在p H 值2 ．0 —1 2 ．O 的緩沖液中，3 7 。C 水浴5 h 后，r h T F F l 和r h T F F 2融合蛋白殘余量為9 0 ％．9 8 ％。4 ．r h T F F l 和r h T