Toll樣受體4在長春瑞濱致靜脈內(nèi)皮損傷中的作用研究.pdf

1、目的：探討Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)在長春瑞濱(Vinorelbine，VIN)致靜脈內(nèi)皮損傷中的作用。
　　方法：1.Toll樣受體4在長春瑞濱致小鼠靜脈炎中的作用研究：取20只BALB/c小鼠，按隨機數(shù)字表隨機分為2組，每組10只。實驗組按38mg/kg尾靜脈注射3.2 g/L長春瑞濱；對照組尾靜脈注射相同體積的生理鹽水(Normal Saline，NS)。于給藥后48h頸椎脫臼處死小

2、鼠，并取近心端距穿刺點1cm處鼠尾組織，4％多聚甲醛中固定后以0.5mol/L乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetra-acetic acid，EDTA)進行脫鈣1周，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色后顯微鏡下進行組織學(xué)分析；免疫組織化學(xué)染色觀察TLR4在小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細胞的表達。2.Toll樣受體4在長春瑞濱致人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷中的作用研究：取長勢良好的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical ven

3、ous endothelial cells，HUVEC)，接種于纖維連接蛋白處理的24孔板或無菌培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至融合度為90％-95％時，加入長春瑞濱終濃度為0.05mg/L的EGM-2培養(yǎng)基，共同培養(yǎng)1h后，PBS洗滌，換入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0h、6h、12h，以相同培養(yǎng)條件下不加藥物處理的細胞為空白對照。利用熒光定量PCR和Western Blot的方法檢測藥物處理后不同時間點TLR4的mRNA和蛋白表達水平；同時利

4、用免疫熒光檢測藥物處理對核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65核轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果：1.組織病理學(xué)：實驗組小鼠尾靜脈血管出現(xiàn)內(nèi)皮細胞脫落、血栓形成和炎細胞浸潤等病理學(xué)改變，對照組小鼠尾靜脈血管無明顯損傷表現(xiàn)；免疫組織化學(xué)染色：實驗組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細胞高表達Toll樣受體4(0.273±0.012)，對照組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細胞Toll樣受體4陰性或弱表達(0.097±0.009)。2

5、.人臍靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)改變：0.05mg/L長春瑞濱干預(yù)1h后人臍靜脈內(nèi)皮細胞拉伸，延展，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，排列紊亂，部分細胞懸浮脫落。洗去長春瑞濱換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h后，細胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常；熒光定量PCR法檢測各組細胞TLR4基因表達水平，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，各時間點TLR4mRNA表達量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中干預(yù)1h后升高幅度最大；Western Blot檢測各時間點絀胞TLR4

6、蛋白表達水平，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，各時間點TLR4蛋白表達量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著時間的增長TLR4蛋白表達量遞增；免疫熒光檢測NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，各時間點NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.長春瑞濱注射小鼠尾靜脈可造成靜脈炎。2.長春瑞濱上調(diào)血管內(nèi)皮細胞TLR4蛋白及其mRNA的表達，促進HUVEC NF-κB的活化