肝癌特異性內(nèi)在化肽的篩選和初步鑒定.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種分布范圍較廣、危害嚴(yán)重的致死性疾病，在全球癌癥死亡率中居第3位，在我國為第2位癌癥死因。近年來，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，人們對癌癥生物學(xué)有了進(jìn)一步認(rèn)識，原發(fā)性肝癌的研究有了很大進(jìn)展。傳統(tǒng)的肝癌治療主要以手術(shù)、放化療、生物治療和中醫(yī)藥治療為主。20世紀(jì)80年代以來，隨著抗體技術(shù)的進(jìn)步，特別是單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，肝癌的導(dǎo)向治療顯示出巨大的應(yīng)用前景。1980年美國Order首先嘗試用<'131>I標(biāo)記的抗

2、體對肝癌進(jìn)行導(dǎo)向治療，有效地提高了治療效果。十幾年來國內(nèi)外學(xué)者通過不同親肝癌載體、抗肝癌細(xì)胞毒物質(zhì)以及多種綜合治療手段的探索，極大地豐富了肝癌導(dǎo)向治療的研究。但是，抗體在導(dǎo)向治療中仍然存在著許多問題：分子量大影響藥物的組織穿透力，鼠源性抗體的異源性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生不良的免疫反應(yīng)等，不僅對患者的身體造成傷害，而且影響到整個腫瘤治療的效果。而特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞的短肽，由于其分子量小，有利于降低免疫原性，增加偶聯(lián)藥物的穿透性，用此替代單克隆抗體可

3、以提高腫瘤治療的效果。另外，利用具有內(nèi)在化能力的抗體或短肽，在理論上可以進(jìn)一步提高腫瘤導(dǎo)向治療的殺傷效果。因為內(nèi)在化抗體或短肽與藥物偶聯(lián)后組成的免疫毒素或免疫脂質(zhì)體，不僅可以將藥物定向地帶至特定的細(xì)胞，而且還可以將藥物運(yùn)輸至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，提高殺傷效率，降低系統(tǒng)毒性，以更好地發(fā)揮藥物的藥理作用。因此，獲得內(nèi)在化肽具有重要的應(yīng)用前景。 噬菌體肽庫技術(shù)的發(fā)展為尋找親和力高、特異性強(qiáng)的腫瘤靶向肽提供了一種更為便捷的途徑，在此基礎(chǔ)之上采用

4、特殊的篩選方法還可以獲得能夠被靶細(xì)胞內(nèi)吞的噬菌體肽，即內(nèi)在化肽。目前已經(jīng)有許多成功得到內(nèi)在化肽并初步探索其應(yīng)用的報道。 本論文擬利用噬菌體展示肽庫技術(shù)，篩選到與肝癌細(xì)胞BEL-7404具有特異性結(jié)合能力并且可以內(nèi)在化的短肽，并對這些短肽進(jìn)行了體內(nèi)、體外的鑒定，從而為其作為導(dǎo)向治療的載體提供一定的理論依據(jù)。 本論文主要分成以下幾個部分： 一、利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選肝癌特異性內(nèi)在化肽利用NEB公司的噬菌體線性12-肽

5、文庫，針對肝癌細(xì)胞株BEL-7404，通過3輪內(nèi)在化篩選方法，得到10<'5>個與靶細(xì)胞特異性結(jié)合并內(nèi)在化的噬菌體單克隆。同時在每輪篩選的過程中，利用噬菌體效價的測定及時檢測和比較每輪篩選得到的噬菌體數(shù)目，實驗結(jié)果說明，通過三輪的內(nèi)在化篩選，噬菌體量從10<'3>增加到10<'5>，得到了有效的富集。在對篩選得到的噬菌體進(jìn)行單克隆化后，隨機(jī)選取了20個噬菌體單克隆進(jìn)行測序，并對所得到的DNA序列進(jìn)行比對和分析。通過測序，20個克隆共得到

6、4種序列，分別是DLNYFTI,SSKRE(17/20)、DLNYLTLSSKRE(1/20)、DLNYHARSYKRE(1/20)、NLKLLDSQDWDG(1/20)，其中，前3個噬菌體克隆都含有共同序列DLNY和KRE。(括號中所示的是每個克隆的出現(xiàn)頻率) 二、噬菌體內(nèi)在化肽體內(nèi)外活性鑒定1．體外活性鑒定利用細(xì)胞ELISA的方法，對4種噬菌體克隆的特異性結(jié)合能力進(jìn)行鑒定。通過OD值比較，相比野生型噬菌體M13，四種克隆都與肝癌細(xì)胞

7、有明顯的親和作用(p<0.05)。從免疫熒光直接觀察的結(jié)果來看，4個噬菌體克隆可以內(nèi)在化進(jìn)入肝癌細(xì)胞BEL-7404和BEL-7402細(xì)胞中，而不能進(jìn)入對照正常肝細(xì)胞HL-7702和正常人胚。腎細(xì)胞HEK-293中；同時，內(nèi)在化抑制劑的加入明顯抑制了噬菌體肽的內(nèi)在化，進(jìn)一步說明了其內(nèi)在化能力：此外，隨著溫育時間的增加，LJ01進(jìn)入肝癌細(xì)胞BEL-7404中的數(shù)量隨之增多。流式細(xì)胞術(shù)定量鑒定的結(jié)果表明，相比較野生型噬菌體，4個克隆都可以內(nèi)

8、在化進(jìn)入肝癌細(xì)胞中，并且不同細(xì)胞內(nèi)熒光比較結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞BEL-7404、BEL-7402內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度明顯的強(qiáng)于對照的HL-7702細(xì)胞。利用WesternBlotting技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)噬菌體克隆LJ01僅與肝癌細(xì)胞表面某種分子量約為32.3kd的膜蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而不能與正常肝細(xì)胞中的蛋白發(fā)生結(jié)合。 2．體內(nèi)活性鑒定我們選擇噬菌體單克隆LJ01進(jìn)行體內(nèi)回輸實驗，對其在體內(nèi)各組織的分布情況進(jìn)行鑒定，通過噬菌體效價測定

9、，噬菌體在腫瘤組織中的富集率是其他正常組織的3倍以上。免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤組織內(nèi)可見棕色著色，判斷是噬菌體肽富集的結(jié)果。 三、化學(xué)合成內(nèi)在化肽體內(nèi)外活性鑒定1．體外活性鑒定將熒光素FAM標(biāo)記的多肽LJ01直接與人肝癌細(xì)胞株BEL-7404、BEL-7402、人正常肝細(xì)胞株HL-7702、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1299、A549，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446，舌鱗癌細(xì)胞株TCA8113，高轉(zhuǎn)移卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株H0

10、8910PM共8種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞溫育后觀察，F(xiàn)AM-LJ01可以內(nèi)在化進(jìn)入肝癌細(xì)胞BEL-7404和BEL-7402細(xì)胞內(nèi)，NCI-H1299細(xì)胞中￥的微弱綠色熒光表明LJ01也可以進(jìn)入這株非小細(xì)胞癌細(xì)胞株內(nèi)，而正常細(xì)胞HL-7702以及其他腫瘤細(xì)胞內(nèi)未見著色。流式細(xì)胞結(jié)果表明，BEL-7404和BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度要高于HL-7702細(xì)胞。 2．體內(nèi)活性鑒定將FAM-LJ01 通過尾靜脈注射的方式打入荷瘤裸鼠體內(nèi)，

11、循環(huán)后取組織，切片，熒光顯微鏡觀察可見，F(xiàn)AM-LJ01 可以很好的富集在腫瘤組織中，在正常肝組織中僅見微弱的綠色熒光，而在其他組織卻少見熒光。從上面的實驗結(jié)果我們可以得到以下結(jié)論： 1．本研究成功地從噬菌體隨機(jī)12-肽文庫中篩選到了4個在體內(nèi)、外均具有特異性靶向并內(nèi)在化能力的噬菌體克?。?2．具有特異性內(nèi)在化能力的噬菌體展示肽的同源性序列為DLNYFTLSSKRE(17/20)、DLNYLTLSSKRE(1/20)、D