殼聚糖-β-甘油磷酸鈉復(fù)合膜緩釋蛋白及引導(dǎo)骨再生性能的研究.pdf

1、目的:
　　 本研究的主要目的是研制一種新型可吸收性膜，簡(jiǎn)化成膜條件、步驟，降低成本，并通過(guò)緩釋促成骨因子改善其引導(dǎo)骨再生的效果。具體來(lái)說(shuō)主要為:(1)利用殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(CS/β-GP)溫敏凝膠在生理?xiàng)l件下即可隨溫度發(fā)生相轉(zhuǎn)變的性能，結(jié)合臨床對(duì)引導(dǎo)骨再生膜的要求，比較各種濃度配比制備的新型復(fù)合膜的理化性能。(2)以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)為模型蛋白，研究并比較不同濃度配比復(fù)合膜的蛋白

2、緩釋性能。(3)利用乙酸法提取并鑒定釉基質(zhì)蛋白（enamelmatrixproteins，EMPs），探討復(fù)合膜添加EMPs后在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中引導(dǎo)骨再生的性能。
　　 方法:
　　 (1)復(fù)合膜的制備及配比選擇:在冰浴條件下分別將不同含量的β-GP溶液逐滴加入以0.1mol/L的乙酸溶液配成的相同濃度的CS溶液中，獲得澄清、均質(zhì)的A(含β-GP0.6g)、B(含β-GP0.8g)、C(含β-GP1.0g)三組溶液;檢測(cè)各組

3、溶液PH值，倒置法測(cè)凝膠時(shí)間;干燥法成膜后測(cè)量比較各組膜厚度和拉伸強(qiáng)度;
　　 (2)復(fù)合膜的蛋白緩釋實(shí)驗(yàn):制備A(含β-GP0.6g)、B(含β-GP0.8g)、C(含β-GP1.0g)三組添加20mgBSA的復(fù)合膜，成膜后各切取其1/4浸入PBS緩沖液中，分光光度儀測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值，據(jù)所得數(shù)值繪制蛋白緩釋曲線;
　　 (3)復(fù)合膜負(fù)載EMPs引導(dǎo)骨再生:綜合分析前階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇含適宜配比的CS/β-GP復(fù)合

4、膜進(jìn)行體內(nèi)外引導(dǎo)骨再生實(shí)驗(yàn);
　　 1)EMPs的提取及鑒定:乙酸法提取健康幼豬恒牙胚中的EMPs，并以SDS-PAGE電泳分析鑒定;
　　 2)體外實(shí)驗(yàn)部分:負(fù)載EMPs的CS/β-GP(1.0g)復(fù)合膜（A組），單純CS/β-GP(1.0g)復(fù)合膜（B組），空白對(duì)照組（C組）三組復(fù)合膜與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)共培養(yǎng)。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性的檢測(cè)，對(duì)比研究復(fù)

5、合膜緩釋蛋白在體外對(duì)ST2細(xì)胞活性的影響。
　　 3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:將10只健康成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為甲、乙兩組，在其顱骨中線兩側(cè)制造直徑0.5cm的極量骨缺損(criticalsizedefect，CSD);左側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)覆蓋負(fù)載EMPs的CS/β-GP(1.0g)復(fù)合膜，右側(cè)為對(duì)照側(cè)涂抹同濃度EMPs溶液并覆蓋不負(fù)載EMPs的CS/β-GP(1.0g)復(fù)合膜;分別于1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)處死甲乙兩組大鼠，通過(guò)大體觀察、X線

6、及組織切片的方法比較1個(gè)月和2個(gè)月后兩種復(fù)合膜修復(fù)骨缺損的情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)復(fù)合膜的制備及配比選擇:A、B、C三組不同濃度的CS/β-GP溶液的PH值均在7左右，隨著β-GP含量增高，PH值也隨之增加;各組溶液均可發(fā)生凝膠相轉(zhuǎn)變且β-GP含量越高，凝膠時(shí)間越短;各組溶液均可干燥成膜，以PBS緩沖液浸泡后，力學(xué)測(cè)定抗拉強(qiáng)度達(dá)到1Mpa左右，符合體內(nèi)應(yīng)用的要求，抗拉強(qiáng)度隨β-GP含量增高而降低。
　　

7、 (2)復(fù)合膜的蛋白緩釋實(shí)驗(yàn):添加BSA前后的不同組分的CS/β-GP溶液的PH值，凝膠時(shí)間，復(fù)合膜的厚度、拉伸強(qiáng)度的差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;繪制出不同組分CS/β-GP復(fù)合膜的BSA緩釋曲線，它們的釋放趨勢(shì)是類似的，但是速率是不完全相同的。不同濃度的復(fù)合膜最終釋放蛋白量不同，并且隨著β-GP濃度的升高，總的蛋白緩釋量是增大的。
　　 (3)復(fù)合膜負(fù)載EMPs引導(dǎo)骨再生實(shí)驗(yàn)部分:選擇含1.0gβ-GP的CS/β-G

8、P復(fù)合膜進(jìn)行體內(nèi)外引導(dǎo)骨再生實(shí)驗(yàn);
　　 1)EMPs提取及鑒定:乙酸法提取EMPs經(jīng)凍存呈白色絮狀;SDS-PAGE電泳、染色顯示:25KDa以下有多個(gè)條帶染色顯影，寬度及染色程度不一，以20KDa附近條帶最為清晰;
　　 2)體外部分:CS/β-GP(1.0g)溶液及復(fù)合膜中添加EMPs前后，PH值、凝膠時(shí)間、膜的厚度及拉伸強(qiáng)度的數(shù)值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ST2與復(fù)合膜共培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)及增殖正常。M

9、TT結(jié)果:培養(yǎng)3、4、5d的時(shí)點(diǎn)A、B、C三組吸光度值（OD值），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A、B組OD值均高于空白對(duì)照組（C組），A組OD值高于B組(P＜0.05)，且各組組內(nèi)在不同時(shí)點(diǎn)的OD值差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ALP活性的檢測(cè)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A、B組與空白對(duì)照組相比，A、B組ALP表達(dá)高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且A組ALP表達(dá)高于B組(P＜0.05);
　　 3)體內(nèi)部分:實(shí)驗(yàn)

10、動(dòng)物均健康成活，傷口Ⅰ期愈合。X線片示:1個(gè)月時(shí)，顱骨實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的極量骨缺損范圍均略有縮小，實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損略小于對(duì)照側(cè);2個(gè)月時(shí)，顱骨實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的極量骨缺損范圍均明顯縮小，此時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損明顯小于對(duì)照側(cè)，缺損一大部分已被修復(fù)。SIDEXIS軟件測(cè)量骨缺損區(qū)域內(nèi)新生骨的骨密度百分比，結(jié)果示:術(shù)后1個(gè)月及2個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的骨密度百分比的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;組織學(xué)切片觀察:術(shù)后1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)均可見(jiàn)少量新

11、骨增生反應(yīng);術(shù)后2個(gè)月，實(shí)驗(yàn)側(cè)內(nèi)新骨增生反應(yīng)更為顯著，骨質(zhì)更為致密、成熟。
　　 結(jié)論:
　　 (1)無(wú)論是否添加蛋白成分，CS/β-GP溫敏凝膠在生理?xiàng)l件下均可隨溫度發(fā)生相轉(zhuǎn)變，干燥法形成復(fù)合膜，基本滿足屏障膜理化性能的要求。含1.0gβ-GP的復(fù)合膜理化性能最接近體內(nèi)外應(yīng)用的要求。
　　 (2)以BSA為模型蛋白，比較發(fā)現(xiàn)不同濃度配比復(fù)合膜的蛋白緩釋性能略有不同，含1.0gβ-GP的復(fù)合膜緩釋蛋白總量最高。<