防風(fēng)有效成份抗動脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是許多心血管病與腦卒中的誘發(fā)因素，其病因復(fù)雜；從19世紀(jì)中葉到20世紀(jì)70年代，Virehow、Dugwid等分別提出了動脈炎性損傷學(xué)說、脂源性假說，從不同角度解釋了AS的形成機(jī)制。但進(jìn)入20世紀(jì)90年代，對于動脈粥樣硬化病理生理機(jī)制的理解發(fā)生了重大改變，超越了動脈粥樣硬化是血管進(jìn)行性阻塞這一傳統(tǒng)觀念的局限，Ross以新的論據(jù)在他損傷反應(yīng)學(xué)說的基礎(chǔ)上，明確提出：動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病而不是單純的由于脂質(zhì)沉積所致

2、。隨著對動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的深入研究，炎癥在AS形成中的作用已被越來越多的資料所證實(shí)，可以認(rèn)為As是以慢性炎癥過程為基礎(chǔ)，炎性細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及免疫因素等環(huán)節(jié)共同參與的綜合發(fā)生發(fā)展過程，為AS治療學(xué)的進(jìn)步及未來關(guān)于AS的理論研究提出了新思路。 在中醫(yī)學(xué)中，有關(guān)AS的臨床辯證分別歸屬于心悸、胸痹心痛，治療多采用活血化瘀等具有綜合調(diào)節(jié)功效的方劑，治療過程中體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，與AS發(fā)

3、生機(jī)制的理論變革有密切相關(guān)性。防風(fēng)是具有疏風(fēng)解表、辛溫通陽作用的風(fēng)藥，新近研究表明，風(fēng)藥具有活血化瘀的功效，開展防風(fēng)抗AS的研究，有助于豐富中醫(yī)風(fēng)藥活血的理論內(nèi)涵?，F(xiàn)代藥理研究表明，防風(fēng)具有顯著的抗炎活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，升麻苷和5-0甲基維斯阿米醇苷是防風(fēng)主要的抗炎成分，現(xiàn)已作為防風(fēng)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定性、定量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究項(xiàng)目從中西醫(yī)結(jié)合的理論出發(fā)，根據(jù)As的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，針對炎性因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等綜合因素在AS發(fā)生中

4、的相互作用，研究升麻苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷對AS炎性反應(yīng)的影響，為拓展中醫(yī)風(fēng)藥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 根據(jù)Ross的AS炎癥假說，ox-LDL等誘發(fā)因素引起血管內(nèi)皮損傷或功能障礙，刺激內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放IL-6、TNF-α等炎性因子，這些炎癥因子繼而刺激平滑肌細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致AS斑塊的形成與發(fā)展。本研究采用體外ox-LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞模型、促黏附模型及TNF-α刺激平滑肌細(xì)胞增殖模型，探討升麻苷和5-0-甲

5、基維斯阿米醇苷抗AS炎性反應(yīng)，研究工作主要包括以下三個方面： 1升麻苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷對于ox-LDL所致心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生存率和分泌炎性細(xì)胞因子的影響參照Nishida等的方法，建立了大鼠乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。采用免疫熒光法對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制了細(xì)胞的生長曲線。在掌握乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長特性后，選用第三代內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。通過測定升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷對內(nèi)

6、皮細(xì)胞活性的影響，確定升麻苷和5-0甲基維斯阿米醇苷的實(shí)驗(yàn)濃度；通過測定ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，確定ox-LDL造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷的造模濃度；然后通過MTT法測定了升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷預(yù)處理后，對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，并分別采用ELISA與放免法的方法，測定了升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷對ox-LDL致心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： ①免疫熒光法鑒定所培

7、養(yǎng)的乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞因子Ⅷ相關(guān)抗原陽性，結(jié)合細(xì)胞呈單層鋪路石樣生長的形態(tài)學(xué)特征，可確定培養(yǎng)的細(xì)胞為心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞； ②根據(jù)繪制細(xì)胞生長曲線，以一定細(xì)胞密度鋪板(1x10<'6>·mL<'-1>)，在鋪板后24h-72h之間細(xì)胞處于指數(shù)增長期，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)期； ③采用MTT法測定升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷毒性較小，測不出對內(nèi)皮細(xì)胞的最大無毒濃度

8、，因此選擇50 μg·ml<'-1>、100 μg·ml<'-1>、200 μg·ml<'-1>三個濃度作為升麻苷和5-0甲基維斯阿米醇苷的實(shí)驗(yàn)濃度； ④采用MTT法測定ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，確定在MDA含量為3ng·ml<'-1>的ox-LDL作用下，內(nèi)皮細(xì)胞損傷較明顯，可建立穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，故選用此濃度作為ox-LDL的造模濃度。 ⑤采用MTT法測定升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷預(yù)處理后，對ox

9、-LDL導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響，結(jié)果表明MDA含量為3nmol·ml<'-1>的ox*LDL能夠明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞存活率，使模型組細(xì)胞吸光值明顯下降，與空白組相比差異極顯著(P(0.01)。升麻苷200μg·ml<'-1>，5-0甲基維斯阿米醇苷50 μg·ml<'-1>、100μg·ml<'-1>、200 μg·ml<'-1>均能明顯抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，與ox-LDL組相比差異極顯著(P<0.01)。升麻苷50

10、μg·ml<'-1>、100 μg·ml<'-1>具有減輕ox-LDL損傷作用的趨勢，但與ox-LDL組相比，差異不顯著。 ⑥采用ox-LDL(MDA含量為3nmol·ml<'-1>)造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷(濃度均分別為50 μg·ml<'-1>、100 μg·ml<'-1>、200μg·ml<'-1>)預(yù)處理，觀察這兩種藥物對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子釋放的影響，結(jié)果表明：ox-LDL能

11、夠明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、TNF-α的分泌量，與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。升麻苷和5-0甲基維斯阿米醇苷100 μg·ml<'-1>、200 μg·ml<'-1>組均能明顯抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6，與模型組相比差異顯著(P<0.05)：升麻苷三個劑量組和5-0甲基維斯阿米醇苷200 μg·ml<'-1>組能明顯抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α，與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。2升麻苷、

12、5-0-甲基維斯阿米醇苷對于心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附的影響參照Nishida等的方法，建立了大鼠乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，采用第三代內(nèi)皮細(xì)胞，觀察升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附性的影響。 從以上結(jié)果可以看出，升麻苷與5-0甲基維斯阿米醇苷具有抑制ox-LDL刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞引起的損傷及炎性因子釋放、抑制ox-LDL引起的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附性增高、抑制TNF-α引起