針對(duì)EGFR的RNA干擾聯(lián)合紫杉醇治療激素非依賴型前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：前列腺癌是男性泌尿系最常見(jiàn)的腫瘤之一，而針對(duì)晚期前列腺癌的有效治療方法極為有限，特別是當(dāng)激素依賴型前列腺癌（ADPC）轉(zhuǎn)化為激素非依賴型前列腺癌（AIPC）后臨床缺乏有效的治療方法，而且預(yù)后較差。臨床上通常采用化療，但療效不滿意，而且由于多數(shù)AIPC患者年齡均>65歲，難以承受常規(guī)劑量的化療及療程。 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是表皮生長(zhǎng)因子基因（erbB）家族的一員，是一種分子量170kDa的跨膜酪氨酸激酶受體，由

2、膜外結(jié)合區(qū)域、跨膜轉(zhuǎn)換區(qū)域和胞質(zhì)反應(yīng)區(qū)域三部分組成。其中胞內(nèi)部分具有酪氨酸激酶活性和ATP底物磷酸化結(jié)合部位。EGFR廣泛存在于許多病理和生理性上皮組織，其與特異性配體EGF或TGF-α結(jié)合后轉(zhuǎn)化為二聚體，同時(shí)，EGFR酪氨酸激酶區(qū)的自身磷酸化后被活化，細(xì)胞內(nèi)蛋白分子磷酸化，最終將信息傳到胞核內(nèi)，啟動(dòng)與細(xì)胞增殖、遷移、粘附、侵入、凋亡、終止以及耐藥性增強(qiáng)等有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。50-90％的激素非依賴型前列腺癌都出現(xiàn)EGFR的過(guò)表達(dá)，而且

3、EGFR的過(guò)表達(dá)與ADPC轉(zhuǎn)化為AIPC密切相關(guān)，前列腺癌組織在雄激素剝奪后對(duì)EGF所產(chǎn)生的生長(zhǎng)促進(jìn)作用非常敏感，全面阻斷酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)治療晚期AIPC這一思路受到重視，于是，抑制生長(zhǎng)因子受體，特別是EGFR的表達(dá)或發(fā)揮作用成為治療AIPC極有希望的治療策略。 盡管人們?cè)趹?yīng)用EGFR單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑治療腫瘤方面取得了較大的進(jìn)步，但應(yīng)用于二期臨床治療AIPC效果卻不太滿意，通過(guò)抑制EGFR表達(dá)來(lái)治療腫瘤

4、的方法需要改進(jìn)。 RNA干擾是用與目的基因mRNA相同序列的21-23nt雙鏈小分子RNA來(lái)特異性高效率的抑制目的基因蛋白表達(dá)，有研究表明，帶有shRNA表達(dá)框架的載體可以取得特異性使靶基因沉默的作用。 前列腺在解剖上具有容易到達(dá)，適于反復(fù)穿刺注射攜帶shRNA表達(dá)框架的病毒載體進(jìn)行靶向治療的優(yōu)點(diǎn)。而且存在特異性瘤標(biāo)，易于隨訪療效。 本研究以雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC-3作為研究對(duì)象，應(yīng)用攜帶針對(duì)EGFR基

5、因的shRNA片段的慢病毒顆粒pshRNA-GFP LVEGFRRNAi來(lái)處理，了解其對(duì)EGFR基因的抑制效果；同時(shí)，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，探討pshRNA-GFP LVEGFRRNAi是否存在抑制雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的作用，以及探討pshRNA-GFP LVEGFRRNAi與紫杉醇或Gefitinib聯(lián)合應(yīng)用是否存在抗腫瘤的協(xié)同作用。 方法： 1、針對(duì)EGFR基因的三個(gè)亞型同源區(qū)設(shè)計(jì)siRNA序列以及siRNA表達(dá)載體

6、的構(gòu)建。 2、使用構(gòu)建好的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞（人成纖維肉瘤細(xì)胞），進(jìn)行最有效siRNA序列的篩選。 3、使用最有效的siRNA序列對(duì)應(yīng)的表達(dá)載體進(jìn)行慢病毒顆粒pshRNA-GFP LVEGFRRNAi的包裝和生產(chǎn)。 4、使用高質(zhì)量攜帶目的片段（siRNA）的病毒顆粒pshRNA-GFP LVEGFRRNAi感染宿主細(xì)胞（PC-3），檢測(cè)RNAi效果。 5、使用pshRNA-GFP L

7、VEGFRRNAi治療激素非依賴型前列腺癌荷瘤裸鼠，觀察對(duì)腫瘤抑制效果，并檢測(cè)EGFR、MAPK、Akt、PKC、p-MAPK、p-Akt等蛋白表達(dá)情況。 6、使用pshRNA-GFP LVEGFRRNAi治療激素非依賴型前列腺癌荷瘤裸鼠，并應(yīng)用紫杉醇、Gefitinib進(jìn)行藥物刺激實(shí)驗(yàn)，觀察是否存在抑制腫瘤的協(xié)同效應(yīng)。 結(jié)果： 1、針對(duì)EGFR基因成功設(shè)計(jì)了siRNA序列并構(gòu)建了siRNA表達(dá)載體，而且siRN

8、A表達(dá)載體測(cè)序正確。 2、成功的在HT1080細(xì)胞（人成纖維肉瘤細(xì)胞）中進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后24小時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了70％，且Realtime PCR檢測(cè)顯示成功的抑制了目的基因EGFR的表達(dá)，其中所設(shè)計(jì)的2號(hào)序列的RNAi效果最好，對(duì)目的基因EGFR的表達(dá)抑制效率達(dá)到了90％以上。 3、使用慢病毒包裝質(zhì)粒混合物和siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，生產(chǎn)出高質(zhì)量的攜帶siRNA片段的慢病毒顆粒pshRN

9、A-GFP LVEEGFRRNAi。 4、體外研究中應(yīng)用pshRNA-GFP LVEGFRRNAi感染PC-3細(xì)胞，并應(yīng)用RealTime-PCR法測(cè)得對(duì)EGFR基因抑制比對(duì)照組下降90％（1-0．00851/0．08818），Western Blot法測(cè)得為88．9％（1-0．05396/0．48455），傳代2～3代后仍保持90％左右的抑制率。MTT法檢測(cè)PC-3 EGFR-RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和正常的PC-3細(xì)胞相比，EGF

10、R基因的低表達(dá)明顯減慢了細(xì)胞的增殖速度。 5、對(duì)于PC-3細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)，RNAi的作用效果和Gefitinib （5mg/L）刺激效果相仿，但是二者共同作用時(shí)，效果明顯強(qiáng)于二者中的任何一種。 6、PC-3 EGFR-RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，相當(dāng)于使用Gefitinib （5mg/L）刺激PC-3，EGFR、Akt、MAPK、PKC、p-MAPK、p-Akt蛋白的表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，而且下調(diào)程度相對(duì)較大。 7、

11、應(yīng)用攜帶針對(duì)EGFR的siRNA片段的慢病毒顆粒pshRNA-GFP LVEGFRRNAi靜脈注射后裸鼠瘤體的生長(zhǎng)受到了一定的抑制。 8、使用EGFR-RNAi結(jié)合應(yīng)用紫杉醇、Gefitinib進(jìn)行藥物刺激實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合紫杉醇治療其腫瘤抑制率達(dá)到56．8％，結(jié)合Gefitinib治療組其腫瘤抑制率也達(dá)到54．0％；與對(duì)照組相比RNAi結(jié)合Gefitinib以及紫杉醇組抑瘤率達(dá)62．5％（P<0．01），而且RNAi組以及RNAi