復(fù)合VEGF基因和EPC的膀胱無細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程膀胱的研究.pdf

1、目的：膀胱無細(xì)胞基質(zhì)(BAM)可以作為支架允許組織再生以實(shí)現(xiàn)膀胱擴(kuò)大和重建。但單純采用無細(xì)胞基質(zhì)存在移植物攣縮的問題，顯示單純的無細(xì)胞基質(zhì)誘導(dǎo)組織再生能力不足。無細(xì)胞基質(zhì)本身無營(yíng)養(yǎng)來源，因此，其植入體內(nèi)后快速的血管再生對(duì)于整個(gè)組織的再生具有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)具有促血管生成作用，有助于組織再生。本研究采用含VEGF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染自體外周血EPC后種植于同種異體膀胱無細(xì)胞基質(zhì)，以該無細(xì)胞基質(zhì)

2、進(jìn)行膀胱替代，以期植入的EPC和其旁分泌的VEGF促進(jìn)血管新生，有利于誘導(dǎo)膀胱再生，為獲得來源簡(jiǎn)便、更為理想的膀胱替代材料開辟新的途徑。 方法：采用密度梯度離心法分離小型豬外周血，培養(yǎng)、擴(kuò)增所得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、透射電子顯微鏡和RT-PCR方法進(jìn)行鑒定。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面特異性的標(biāo)記CD133、CD34、CD117、CD44、CD45、CD31、CD144、VEGFR-2。應(yīng)用Dil-acLDL吞噬實(shí)驗(yàn)和

3、Matrigel實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能。構(gòu)建含VEGF基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)VEGF基因的表達(dá)。制備豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)，HE染色、Masson染色和掃描電鏡方法檢查膀胱無細(xì)胞基質(zhì)的特性，同時(shí)應(yīng)用生物力學(xué)方法檢查膀胱無細(xì)胞基質(zhì)的力學(xué)性質(zhì)。隨后VEGF基因修飾的EPC復(fù)合于膀胱無細(xì)胞基質(zhì)上，體外培養(yǎng)3天，然后回植動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建組織工程膀胱以進(jìn)行膀胱擴(kuò)大。以單純膀胱無細(xì)胞基質(zhì)的替

4、代作為對(duì)照。每組各6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在術(shù)后的1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月分別檢查膀胱功能，并處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行組織學(xué)分析和免疫組織化學(xué)染色，計(jì)算新生微血管的密度。 結(jié)果：成功由小型豬外周血分離培養(yǎng)得到內(nèi)皮祖細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定。細(xì)胞的表面標(biāo)記分別為CD13325.1％、CD3415.0％、CD11755.9％、CD4498.4％、CD454.5％、CD3182.0％、CD14495.4％、VEGFR-297.7％。含VEGF基因的腺病毒載體的

5、轉(zhuǎn)染效率超過60-70％。轉(zhuǎn)染后的EPC同時(shí)表達(dá)VEGF蛋白和綠色熒光蛋白。Masson染色和掃描電鏡觀察表明細(xì)胞粘附于膀胱無細(xì)胞基質(zhì)表面，并在其上增殖和生長(zhǎng)。證明膀胱無細(xì)胞基質(zhì)對(duì)EPC無細(xì)胞毒性。組織工程膀胱的功能和組織學(xué)檢查表明膀胱組織隨時(shí)間逐漸再生。新生微血管密度的計(jì)量表明復(fù)合細(xì)胞組的血管密度增加明顯。 結(jié)論：EPC經(jīng)VEGF基因修飾后可以作為種子細(xì)胞，膀胱無細(xì)胞基質(zhì)可以作為支架材料來構(gòu)建組織工程膀胱。VEGF基因修飾后的