冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復(fù)灌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復(fù)灌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 目的：研究冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復(fù)灌損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：采用出生后6-8周健康成年雄性昆明種小鼠，隨機(jī)分為4組(每組8只)：假手術(shù)組、模型組、冬蟲夏草素低劑量組（10mg/kg）、冬蟲夏草素高劑量組（20mg/kg）。冬蟲夏草素組小鼠灌胃給藥(0.1ml/10g體重），假手術(shù)組、模型組小鼠灌胃給雙蒸水（0.1ml/10g體重），

2、每天灌胃一次，連續(xù)給藥七天后，小鼠用10％水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉后行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎，缺血15分鐘后復(fù)灌4小時，建立缺血復(fù)灌損傷模型。
　　 結(jié)果：
　　 1．冬蟲夏草素對小鼠缺血復(fù)灌損傷后大腦皮層以及海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響：
　　 小鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（2VO）缺血15分鐘復(fù)灌4小時后,可見模型組小鼠大腦皮層以及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞明顯損傷，如細(xì)胞核濃縮、核碎裂、核消失、細(xì)胞深染等現(xiàn)象，正常神經(jīng)

3、細(xì)胞數(shù)目顯著減少（與假手術(shù)組相比p<0.01，n=5）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預(yù)處理后則明顯減輕大腦皮層以及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷狀況，神經(jīng)細(xì)胞丟失數(shù)目顯著減少（與模型組相比p<0.05，n=5）。
　　 2．冬蟲夏草素對小鼠缺血復(fù)灌損傷后大腦脂質(zhì)過氧化程度的影響：
　　 假手術(shù)組SOD活力、MDA水平分別為93.54±12.94 (U/mg．Protein)（n=8）、1.83±0.44 (nM/mg．Prot

4、ein)（n=8）。缺血15分鐘復(fù)灌4小時后，腦組織內(nèi)SOD活力降低 48.5％ （與假手術(shù)組相比p<0.01，n=8）。MDA水平升高65.9％（與假手術(shù)組相比p<0.01，n=8）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預(yù)處理后則明顯減輕大腦脂質(zhì)過氧化程度，腦組織內(nèi)SOD活力明顯升高（與模型組相比p<0.05，n=8）。MDA水平明顯降低（與模型組相比p<0.05，n=8）。
　　 3．冬蟲夏草素對小鼠缺血復(fù)灌損傷后腦內(nèi)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)

5、的影響:
　　 缺血15分鐘復(fù)灌4小時后,小鼠大腦內(nèi)五種氨基酸的含量明顯增加,增加比例如下:天冬氨酸(144％)，谷氨酸(117％),甘氨酸(328％),?；撬?121％)，γ氨基丁酸(86％)（與假手術(shù)組相比p<0.05，n=8）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預(yù)處理后則明顯減少大腦內(nèi)五種氨基酸的含量。降低比例如下：天冬氨酸(39％)、谷氨酸(28％),甘氨酸(60％),?；撬?23％)，γ氨基丁酸(36％)（與模型組相比p<0

6、.05，n=8）。
　　 4．冬蟲夏草素對小鼠缺血復(fù)灌損傷后腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶3的影響：
　　 小鼠腦缺血15分鐘復(fù)灌4小時后，腦組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)增加191.5％ （與假手術(shù)組相比p<0.01，n=8）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預(yù)處理后則明顯減少大腦基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)，降低45.8％（與模型組相比p<0.05，n=8）。
　　 5．冬蟲夏草素對小鼠缺血復(fù)灌損傷后大腦皮層及海馬各區(qū)NF-КB表達(dá)

7、的影響：
　　 各組小鼠CA1區(qū)IKKα（IКB-kinase-α）的熒光密度（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）：假手術(shù)組67.66±8.72；模型組117.08±21.41；冬蟲夏草素（10mg/kg）組為89.58±11.32；各組小鼠CA1區(qū)P65（是NF-КB的一種主要亞基，也稱為RelA）的熒光密度（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）：假手術(shù)組63.53±8.94；模型組164.72±19.03；給藥組118.29±11.76。經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計處

8、理，模型組與假手術(shù)組熒光密度相比有極顯著性差異（P<0.01）; 冬蟲夏草素（10mg/kg）組與模型組熒光密度相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1．冬蟲夏草素（10mg/kg）對小鼠腦缺血復(fù)灌損傷具有明顯的保護(hù)作用，其作用可能與降低腦缺血復(fù)灌后脂質(zhì)過氧化程度，減少細(xì)胞外谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸含量，以及抑制細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-3的激活有關(guān)。2．冬蟲夏草素在較高劑量組（20mg/kg）對小鼠

9、腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用不明顯，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 第二部分、冬蟲夏草素對小鼠全腦腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 目的：研究冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復(fù)灌損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：出生后(6-8周)健康成年雄性小鼠隨機(jī)分為5組(每組8只)：正常組、OGD模型組、冬蟲夏草素組(20μМ、40μМ、80μМ），各組小鼠經(jīng)10％水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉斷頭后取腦，

10、使用振蕩切片機(jī)制備腦片，厚400μm，置于持續(xù)通95％O2和5％CO2混合氣體的人工腦脊液（ACSF）中，在室溫條件下孵育30分鐘,以恢復(fù)腦片活性，再置于37℃恒溫水浴箱中孵育30分鐘后，更換無糖人工腦脊液，并通95％ N2和5％CO2混合氣體，進(jìn)行氧糖剝奪損傷15分鐘（正常組除外），然后重新更換人工腦脊液，通入95％O2和5％CO2混合氣體孵育240分鐘，建立腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷模型。用TTC染色和PI染色方法觀察腦片損傷程度。將腦片

11、孵育液收集，試劑盒檢測LDH含量；高效液相色譜法（HPLC）檢測孵育液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸的含量；ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-10的含量。將腦片組織收集并提取蛋白，用Western-blot方法檢測NF-КB通路的IKKα、P65和MAPK通路P-ERK（1/2）的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.冬蟲夏草素對氧糖剝奪復(fù)氧損傷后小鼠腦片活性的影響：
　　 TTC染色結(jié)果、PI染色

12、結(jié)果、孵育液中LDH檢測結(jié)果顯示在氧糖剝奪15分鐘復(fù)氧4小時后，與正常組比較，模型組腦片損傷明顯加重，而冬蟲夏草素20μМ和40μМ處理組能顯著減輕損傷。冬蟲夏草素80μМ減輕損傷的作用不明顯。
　　 2.冬蟲夏草素對腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷后炎癥細(xì)胞因子釋放的影響。
　　 ELISA 檢測結(jié)果反映在腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷后，模型組中兩種細(xì)胞因子IL-1β和IL-10含量均有顯著增加。冬蟲夏草素20μМ、40μМ、80μМ處理

13、組均能顯著降低炎癥因子IL-1β分泌量，而40μМ能顯著增加IL-10分泌量。
　　 3.冬蟲夏草素對腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷后氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響：
　　 HPLC檢測結(jié)果顯示在腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷后，模型組孵育液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、?；撬?、γ氨基丁酸均顯著升高，冬蟲夏草素20μМ、40μМ處理組能明顯降低谷氨酸和天冬氨酸的水平，20μМ組能明顯升高?；撬岬乃健６x夏草素各處理組對于甘氨酸和γ氨基丁酸水平則有

14、不同程度的降低。
　　 4.冬蟲夏草素對腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷后腦組織內(nèi)NF-КB通路和MAPK之 ERK（1/2）通路的影響：
　　 Western-blot實(shí)驗證實(shí)在腦片氧糖剝奪復(fù)氧損傷后，與正常組相比較，模型組腦組織內(nèi)IKKα、P65、P-ERK（1/2）的表達(dá)均顯著增加，冬蟲夏草素20μМ、40μМ、80μМ處理組能明顯降低IKKα、P65的表達(dá)，冬蟲夏草素20μМ、40μМ處理組能明顯降低P-ERK（1/2）的表

15、達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.氧糖剝奪15分鐘復(fù)氧4小時能引起腦片組織明顯的損傷，孵育液中興奮性和抑制性氨基酸含量均顯著增加，炎癥因子IL-1β、IL-10均顯著增加，腦片組織內(nèi)IKKα、P65、P-ERK（1/2）的表達(dá)均顯著增加。
　　 2.冬蟲夏草素對氧糖剝奪復(fù)氧損傷有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低腦片復(fù)氧損傷后細(xì)胞外液中谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸含量，調(diào)節(jié)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸平衡有關(guān)系