前列腺特異性膜抗原新型剪接變異體PSM-E的外周血定量表達檢測分析及其臨床意義探討.pdf

1、研究背景和目的： 前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是歐美國家最常見的男性惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌居第二位。我國前列腺癌發(fā)病率近年來呈顯著增長趨勢。由于多數(shù)前列腺癌發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀輕微，當癥狀發(fā)生時多數(shù)已有局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，晚期PCa治療效果欠佳。如何早期、準確的診斷前列腺癌以便早期及時治療日益受到重視。通過實驗室診斷技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一些敏感性高、特異性強與PCa相關(guān)的指標診斷PCa是關(guān)注的焦點。

2、目前臨床上應(yīng)用最廣泛的標記物前列腺特異性抗原(prostate—specific antigen，PSA)是一個組織特異性而非腫瘤特異性的標記物。前列腺特異性膜抗原(prostate—specific membrane antigen，PSMA)作為與前列腺癌密切相關(guān)的細胞跨膜蛋白，是近年來前列腺癌研究的熱點。PSMA僅為人正常、惡性及轉(zhuǎn)移灶的前列腺細胞所表達，具有很高的前列腺組織特異性。研究者發(fā)現(xiàn)PSMA在正常前列腺組織的表達很少，在

3、前列腺增生及前列腺癌中表達增強，且尤以前列腺癌表達最高，逐漸認識到PSMA比PSA更具有特異性，并在研究過程中還發(fā)現(xiàn)它可用于早期診斷前列腺癌及其轉(zhuǎn)移癌，以及前列腺癌術(shù)后的檢測。 大量組織學(xué)研究結(jié)果證實了PSMA對于前列腺癌的高特異性，但血液學(xué)檢測方面存在爭議，因健康人中也可測到血清PSMA且隨著年齡增長濃度升高，特別是50歲以后升高更明顯，并且健康女性血清PSMA也隨年齡增長而升高及乳腺癌患者血清PSMA水平增高，認為PSMA并

4、非PCa的特異性生物標記，許多正常及疾病組織與血清PSMA水平相關(guān)。在腫瘤的早期階段就有癌細胞進入血循環(huán)，運用高靈敏度的方法檢測外周血中的PSMA mRNA的表達將有助于PCa血行播散的判斷及早期診斷。RT—PCR法可檢測出外周血中少量的mRNA，具有較高靈敏度，可用于PCa的早期診斷。這方面的研究同樣存在爭議，有許多研究證實PSMAmRNA檢測的真實性和可靠性明顯優(yōu)于PSA，其特異性和敏感性更高，同樣也有研究發(fā)現(xiàn)PSMAmRNA在健康

5、人中的假陽性率達38％，認為在PCa的診斷中其臨床效用低，需另行設(shè)計特異性引物及定量分析區(qū)分循環(huán)中的前列腺細胞。 PSMA存在可變剪接現(xiàn)象，通過可變剪接可以改變原有蛋白的功能，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。PSM—E是前期在為進行基因重組PSMA前列腺癌疫苗的研究中，本研究組首次在世界上發(fā)現(xiàn)的一種PSMA新型剪接變異體，基因序列分析及編碼蛋白預(yù)測分析表明，PSM—E不同于PSMA及目前已報導(dǎo)的其它剪接變異體，其基因序列編

6、碼的蛋白可能完全是一種新的細胞跨膜蛋白。而此前已發(fā)現(xiàn)的剪接變異體PSM’、PSM—C、PSM—D則均位于細胞漿，缺少蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白，缺乏PSMA原有的生物學(xué)功能及對前列腺癌診斷和治療時的靶細胞定位作用。 前期研究中我們發(fā)現(xiàn)在腎、膀胱、十二指腸、回腸、肝癌及乳腺癌腫瘤組織中可檢測到PSMA mRNA的轉(zhuǎn)錄物，但新剪接變異體PSM—E則僅在PCa和LNCaP中檢測到，PSM—E僅表達于前列腺癌而在其它器官中缺如；PS

7、M—E mRNA水平在正常前列腺、BPH和PCa間有顯著性差異，并且PSM—E水平隨Gleason評分一起升高。這證明PSM—E是一種較PSMA特異性更高的前列腺標記物，組織PSM—E mRNA表達水平可用于區(qū)分正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌。 既往已有研究證實外周血PSMA檢測對PCa的診斷較PSA特異性更高，那么對于剪接變異體PSM—E來說，PSM—E在PCa和BPH患者的外周血中是否表達？其表達水平是否如同組織學(xué)研究一樣

8、存在差異？能否通過高靈敏度的方法檢測其差異而診斷PCa患者？這些都是本論文要研究的問題。 在此前我們的系列性相關(guān)研究基礎(chǔ)成果上，本課題擬進一步研究外周血PSM—E檢測分析在前列腺良、惡性疾病中的意義。因此，本研究根據(jù)獲得的PSM—E編碼區(qū)基因序列，制備PSM—E的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0/PSM—E，根據(jù)PSM—E、PSMA、PSM’、PSM—C和PSM—D cDNA序列，設(shè)計PSM—E、PSMA特異性引物；定量分析PSM—

9、E mRNA在正常對照、前列腺增生、前列腺癌患者外周血中的表達水平，并分析其差異，以證實PSM—E在前列腺癌患者外周血中的高表達特異性。為尋找前列腺癌靈敏和特異的診斷指標提供新的思路和理論依據(jù)。 方法： 1.PSM—E/PSMA的特異性引物及真核表達載體的制備： 前列腺癌組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PSMA的基因序列設(shè)計含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，PCR擴增cDNA；PCR產(chǎn)物和真核表達

10、載體pcDNA3.0分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選并鑒定氨芐青霉素抗性的陽性克隆增菌測序。提取LNCaP、PC—3細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PSM—E、PSMA、PSM’、PSM—C和PSM—D結(jié)構(gòu)序列特征設(shè)計PSM—E、PSMA特異性引物以區(qū)分其它剪接變異體，并構(gòu)建PSM—E及PSMA的真核表達質(zhì)粒(pcDNA3.0/PSM—E和pcDNA3.0/PSMA)。 2.PCA、B

11、PH及正常對照者外周血PSM—E/PSMA熒光定量PCR檢測及分析： 選取臨床前列腺癌(n=53)、前列腺增生(n=79)患者及正常對照者(n=19)，提取其外周血有核細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別利用PSM—E、PSMA特異性引物，熒光定量PCR檢測PSM—E、PSMA mRNA在正常對照、前列腺增生、前列腺癌患者外周血中的表達水平，以PSM—E/PSMA質(zhì)粒作為檢測標準品，以β—actin質(zhì)粒作為內(nèi)參進行校正，對檢測

12、結(jié)果統(tǒng)計分析其差異及探討其臨床意義。 結(jié)果： 1.成功制備PSM—E、PSMA的真核表達質(zhì)粒(pcDNA3.0/PSM—E和pcDNA3.0/PSMA)及內(nèi)參β—actin質(zhì)粒，設(shè)計了PSM—E及PSMA的特異性引物； 2.外周血PSMA表達在PCa、BPH及正常對照三組間存在差異，方差分析跟獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義，PCa組的均值比正常組低同時比BPH組高。PSMA相對表達量在PCa組(-12.51±0.31

13、)高于BPH組(-13.72±0.48)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。 3.外周血PSM—E表達在PCa、BPH及正常對照三組之間存在差異，方差分析跟獨立樣本t檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義，PCa組的表達高于正常對照及BPH組。PSM—E相對表達量在PCa組(—8.22±0.32)高于BPH組(—9.99±0.41)，P<0.001。 4.PCa組內(nèi)PSM—E表達高于PSMA，差值均數(shù)—4.29，P<0.001；BPH組內(nèi)PSM

14、—E表達同樣高于PSMA，差值均數(shù)—3.73，P<0.001。組內(nèi)PSMA與PSM—E相對表達量分別相關(guān)(r=0.36，p<0.05；r=0.65，p<0.01)，與血清PSA均不相關(guān)。ROC曲線分析表明PSME在診斷PCa的敏感性、特異性方面要優(yōu)于PSMA。 結(jié)論： 1.PSMA的外周血表達在PCa、BPH及正常對照三組間存在差異，但PCa組的均值比正常組低同時比BPH組高。外周血PSMA檢測可用于區(qū)分PCa和BPH患