南瓜蛋白誘導(dǎo)人肝癌Hep-G2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察南瓜蛋白(Cucurmosin，Cus)對人肝癌Hep-G2細(xì)胞的體外增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用；用NOD-SCID小鼠建立人肝癌Hep G2細(xì)胞的肝原位移植瘤模型，評價(jià)Cus在體抗肝癌的有效性；并初步探討其誘導(dǎo)凋亡作用的可能機(jī)制，為南瓜蛋白的抗肝癌機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1 MTT法測定Cus(以TCS為對照)對體外培養(yǎng)人肝癌Hep G2細(xì)胞和人胚肝L-02細(xì)胞增殖的影響，評價(jià)其對人肝癌細(xì)胞作用選擇性；

2、 2利用NOD/SCID小鼠建立人肝癌原位移植模型，體內(nèi)觀察南瓜蛋白對人肝癌小鼠原位移植瘤的抑瘤率。 3電子顯微鏡觀察南瓜蛋白作用后PANC-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 4流式細(xì)胞儀檢測南瓜蛋白對Hep G2細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡發(fā)生率的影響。 5 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測Hep G2細(xì)胞凋亡 6 DNA斷裂瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有凋亡片段 7 ELISA檢測南瓜蛋白作用后Hep G2

3、細(xì)胞的caspase-3和caspase-9活性的變化。 8 western blot法檢測南瓜蛋白作用后caspase-3、bcl-2、bax蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：MTT比色法結(jié)果顯示，Cus對正常人胚肝(L-02)細(xì)胞的毒性作用(IC50為20.85μg/ml)遠(yuǎn)小于對人肝癌(HepG2)細(xì)胞的毒性(IC50為4.96μg/ml)，Cus對人肝癌Hep G2細(xì)胞的具有一定的選擇性。電子顯微鏡下見對照組細(xì)胞形態(tài)正常，

4、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，常染色質(zhì)豐富，可見多個(gè)核仁。治療組而細(xì)胞密度增高，染色質(zhì)凝集固宿，染色質(zhì)邊集，核固宿，核碎裂及凋亡小體的形成等細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)；流式細(xì)胞儀DNA倍體分析檢出典型的亞二倍體(sub-G1)凋亡峰，并且10 ug/mlCucurmosin分別作用24、48、72h，凋亡率分別為11.88％、23.47％、36.24％，呈明顯的時(shí)間依賴性。Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示Cucurmosin作用的劑量依

5、賴性，隨著作用濃度的升高細(xì)胞凋亡率也隨之增加。DNA斷裂瓊脂糖凝膠電泳分析出現(xiàn)“階梯狀”DNA條帶，呈約180-220bp整數(shù)倍遞增分布，提示DNA在核小體部位被切斷，細(xì)胞發(fā)生凋亡。所有上述結(jié)果充分說明，Cucurmosin具有誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞凋亡的作用。 在動物體內(nèi)，人肝癌HepG2細(xì)胞/NOD-SCID小鼠原位移植瘤模型治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Cus對人肝癌移植瘤生長具有顯著抑制作用，1、0.5、0.25mg/kg的Cus對人

6、肝癌原位移植瘤的瘤重抑制率分別為71.11％，64.85％和51.19％。Western blot分析結(jié)果表明：經(jīng)2.5、5、10、20、40μg/ml的Cus處理72h后，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)，Caspase3的活性片段被不同程度的激活，呈濃度依賴性：用Caspase3、Caspase-9活性檢測試劑盒測定，結(jié)果顯示：Caspase3、Caspase-9均被激活，并且呈濃度依賴性。 結(jié)論： 1、Cus

7、對人肝癌Hep-G2細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖抑制作用(IC50為4.96ug/ml)，比TCS對該腫瘤細(xì)胞的作用(IC50約20.15 ug/ml)強(qiáng)4倍多，并且對人胚肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞毒性(IC50約為20.85ug/ml)小，其細(xì)胞毒作用具有相對選擇性。 2、Cus能有效誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。 3、Cus對人肝癌HepG2細(xì)胞小鼠原位移植瘤具有顯著的增殖抑制作用，呈劑量依賴性。 4、Cus誘導(dǎo)HepG2細(xì)