低溫誘導(dǎo)下望天樹幼苗葉片生理生化變化及差異蛋白表達(dá).pdf

1、望天樹(Parashorea chinensis)是龍腦香科柳安屬常綠大喬木，分布狹窄，僅在我國(guó)云南南部、東南部及廣西西南有天然分布，是我國(guó)一級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物。遷地保護(hù)是保存珍貴樹種種質(zhì)資源有效方法之一，也有助于擴(kuò)大其種植范圍，而溫度是影響遷地保護(hù)的重要環(huán)境因子。因此，本研究以望天樹1年生實(shí)生幼苗作為試驗(yàn)材料，進(jìn)行0℃誘導(dǎo)0d、1d、2d的低溫處理以及重新回升到25℃的恢復(fù)處理，探討這4個(gè)階段下幼苗的生長(zhǎng)狀況和生理生化的變化，并采用蛋

2、白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析0℃誘導(dǎo)2d后望天樹葉片差異蛋白的表達(dá)，主要研究結(jié)論如下:
　　1.隨著0℃低溫誘導(dǎo)的進(jìn)行，整株幼苗葉片不斷下垂，且在誘導(dǎo)2d時(shí)幼嫩的葉片發(fā)生萎蔫卷曲;重新回升到25℃后，幼嫩的葉片依舊卷曲，甚至變干，而功能成熟的葉片開始恢復(fù)伸展。
　　2.在0℃低溫誘導(dǎo)及恢復(fù)到25℃過程中，望天樹幼苗葉片中葉綠素a、b以及葉綠素總含量均高于其對(duì)照處理，且其含量的變化總體上是先上升后下降，并在0℃誘導(dǎo)2d時(shí)達(dá)到最大;在0℃誘

3、導(dǎo)0d、1d及2d時(shí)，葉綠素a/b的比值均小于其對(duì)照組，而當(dāng)溫度恢復(fù)到25℃時(shí)，該比值大于其對(duì)照組;類胡蘿卜素總含量在0℃誘導(dǎo)0d和1d時(shí)，也低于其對(duì)照組，在第2d及回溫后，類胡蘿卜素總含量逐漸增大，且均高于其對(duì)照組。葉片相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、游離脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量在0℃誘導(dǎo)期間逐漸增加，在誘導(dǎo)2d時(shí)達(dá)到峰值，而當(dāng)溫度恢復(fù)到25℃后，含量又減少，但在整個(gè)過程中以上各指標(biāo)的值均高于其對(duì)照。葉片SOD、POD、CAT和APX

4、酶的活力也均高于其對(duì)照，酶活力的變化均是先上升后下降，在0℃誘導(dǎo)2d時(shí)達(dá)到峰值，而PPO酶活力變化正與之相反。在0℃低溫誘導(dǎo)期間，IAA和ZR含量沒有顯著差異，當(dāng)溫度回升到25℃時(shí)，二者的含量卻顯著增加。隨著誘導(dǎo)時(shí)間地延長(zhǎng)，GA3和ABA的增加量顯著的上升，且二者的增加量均在0℃誘導(dǎo)2d時(shí)最大，當(dāng)溫度回升后，其增加量又顯著的下降。
　　總之，在0℃誘導(dǎo)2d時(shí)，望天樹幼苗葉片葉綠素、游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、GA3和ABA的

5、含量最高，SOD、POD、CAT和APX酶的活力也最強(qiáng)，而溫度回升后，以上各指標(biāo)的值又顯著降低，且功能成熟的葉片開始恢復(fù)伸展，這說明望天樹對(duì)短暫的低溫脅迫有一定的耐性。
　　3.利用改良TCA-丙酮沉淀法和酚-甲醇/乙酸銨沉淀法提取望天樹葉片總蛋白。經(jīng)對(duì)比，改良TCA-丙酮沉淀法提取的總蛋白含量是改良的酚-甲醇/乙酸銨沉淀法的4.3倍，且電泳條帶較多。因此，采用改良TCA-丙酮沉淀法提取望天樹葉片總蛋白以進(jìn)行差異蛋白表達(dá)的分析。<

6、br>　　4.0℃誘導(dǎo)2d后，采用改良TCA-丙酮沉淀法提取望天樹葉片總蛋白，利用LC-MS/MS結(jié)合TMT定量標(biāo)記技術(shù)對(duì)總蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，再使用SEQUEST軟件在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索。結(jié)果顯示，共鑒定出蛋白質(zhì)481個(gè)，其中表現(xiàn)出差異性的蛋白質(zhì)有96個(gè)，52個(gè)表達(dá)上調(diào)，44個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　5.對(duì)96個(gè)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，(1) GO注釋:差異蛋白參與的生物進(jìn)程有4種，分別為細(xì)胞過程、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、

7、光合作用和核苷酸代謝;所屬的細(xì)胞組分有3種，分別為蛋白復(fù)合物、類囊體和光系統(tǒng);具有的分子功能有2種:核苷結(jié)合和葉綠素結(jié)合;(2)KEGG-Pathway生物通路分析:差異蛋白所參與的生物通路有7種，分別為光合作用、氧化磷酸化、代謝途徑、剪接體、RNA降解、吞噬體和核糖體。參與光合作用和代謝作用的差異蛋白均為光系統(tǒng)Ⅱ家族蛋白、光系統(tǒng)Ⅱ亞基Q-2和F1ATP酶γ亞基，表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)1ATP酶γ亞基還參與到氧化磷酸化通路中;參與剪接體和RNA降

8、解通路的差異蛋白均為小核核糖核蛋白家族蛋白，表達(dá)上調(diào);參與吞噬體和核糖體通路的差異蛋白分別是β-6微管蛋白同種型1和60S酸性核糖體蛋白P2B，兩者均表達(dá)下調(diào);(3) STRING蛋白互作分析:只有光和電子傳遞相關(guān)的光系統(tǒng)Ⅱ亞基QA和光系統(tǒng)Ⅱ亞基Q-2兩種蛋白質(zhì)之間有互作關(guān)系。結(jié)合GO和Pathway分析可以看出低溫對(duì)望天樹的光合作用有較大的影響，因?yàn)檫@三種分析結(jié)果均涉及與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)。
　　綜上所述，望天樹通過參與到多種