一株溶血栓細(xì)菌的鑒定及其溶栓活性成分的研究.pdf

1、心腦血管疾病已成為對(duì)人類健康的最大威脅之一。近幾十年來，該病的發(fā)病率逐漸升高，對(duì)溶栓藥物的需求大增，因此研制溶栓藥具有十分重要的意義。本研究對(duì)一株來自青藏高原海拔4300 m的河流泥土的纖溶酶高產(chǎn)菌株DR-929進(jìn)行鑒定，并對(duì)該細(xì)菌分泌的纖溶酶進(jìn)行分離純化和探索其在動(dòng)物體內(nèi)的抗栓、溶栓效果。 (1)通過生理生化特征和16S rRNA基因序列分析對(duì)菌株DR-929進(jìn)行了鑒定。生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株DR-929與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌

2、具有高度相似性，其16S rRNA基因序列分析結(jié)果顯示，菌株DR-929的16S rRNA基因序列與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌具有同源性，二者在進(jìn)化分析中被聚為一類，可信度達(dá)到99％。另外，該菌并不產(chǎn)生溶血素，而且其普通肉湯培養(yǎng)物對(duì)小鼠也沒有毒性。 (2)菌株DR-929分泌纖溶酶的液體發(fā)酵優(yōu)化條件為：可溶性淀粉2.0％，黃豆粉1.0％，NaCl 1.0％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.05％，種齡36 h，發(fā)酵時(shí)間4 d，初始

3、pH8.0或8.0，溫度25℃，裝樣量30 mL，接種量5％或6％，經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵條件后活力達(dá)188.66IU/mL。 (3)經(jīng)硫酸銨鹽析、疏水層析、Q FF陰離子交換層析以及G-75葡聚糖凝膠過濾層析等步驟，分離純化得到菌株DR-929分泌的纖溶酶，其在SDS-PAGE凝膠電泳膠上呈單一均勻的條帶，純化倍數(shù)為271.5倍，回收率為24.5％，活性為7003.8 IU/mg(以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn))。 (4)菌株DR-929分泌的纖

4、溶酶的分子量為28300 Da，最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為45℃和pH 8.0，其在45℃溫度下穩(wěn)定，并且在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)也比較穩(wěn)定。另外，該纖溶酶是一種金屬蛋白酶，活性能被EDTA完全抑制，而PMSF不影響其活性。該酶也屬于纖維蛋白溶解酶類，其不具有纖維蛋白溶酶原激活劑的功能。 (5)采用小鼠抗凝血模型、大鼠靜脈血栓形成模型和兔頸動(dòng)脈血栓模型探索了菌株DR-929分泌的纖溶酶(FA-I)分別經(jīng)口服、腸道給藥和

5、靜脈注射后在體內(nèi)的藥效。結(jié)果顯示：FA—I明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間(CT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化的部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶時(shí)間(TT)(P<0.05或P<0.01)，顯著降低優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)和纖維蛋白原(FIG)含量(P<0.01)，并且能改善血液流變狀態(tài)。表明FA-I無論靜脈注射還是口服均能達(dá)到抗栓、溶栓效果。 綜上所述，本研究中菌株DR-929分泌的纖溶酶可能是一種新型的纖維蛋白溶解酶，其體內(nèi)溶栓效果表明