一株具有抑真菌作用的芽孢桿菌鑒定及其抑菌活性成分分析.pdf

1、植物真菌病害往往給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失，芽孢桿菌常被用作植物真菌病害防治的菌株，在植物真菌病害防治中發(fā)揮著重要作用。本課題對(duì)一株可以抑制真菌生長的芽孢桿菌NK-2展開研究，通過菌落對(duì)峙法檢測其抑真菌活性，發(fā)現(xiàn)它對(duì)八種常見的植物病害真菌：黑曲霉(Aspergillium niger)、黃瓜灰霉(Botrytis cinerea)、小麥赤霉（Fusarium graminearum）、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、產(chǎn)黃

2、青霉(Penicillium chrysogenum)、蘋果輪紋病菌(Physalospora piricola)、黑根霉（Rhizopus nigricans）及棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）均有較好的抑制作用，表現(xiàn)出較廣的抑菌譜。盆栽法實(shí)驗(yàn)表明，NK-2菌的發(fā)酵液可以有效抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的發(fā)生，經(jīng)其發(fā)酵液處理后，植株發(fā)病指數(shù)為32.4，平均防效為64.1％，這也為我們開發(fā)該菌

3、株并將其應(yīng)用于田間提供了良好的依據(jù)。
　　 從分子水平上利用基因序列的差異比較推測細(xì)菌間進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而對(duì)未知細(xì)菌進(jìn)行鑒定和檢測，是現(xiàn)代細(xì)菌菌種鑒定的一種科學(xué)的方法。本研究采用16SrDNA(GenBank accession: GU064894)、gyrA(GenBank accession: GU226662)、rpoB(GenBank accession: GU226663)等基因作為分類鑒定基因，并分別利用gyrA和rpo

4、B基因構(gòu)建了分子進(jìn)化樹，鑒定結(jié)果表明它是一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
　　 為分離NK-2抑菌活性成分，我們對(duì)其發(fā)酵液采用經(jīng)典的硫酸銨(65%)沉淀方法，經(jīng)透析、超濾管(30kDa)濃縮后得到具有抑制真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的活性粗蛋白。隨后對(duì)該粗蛋白的耐受溫度、pH值耐受范圍、有機(jī)溶劑耐受性、蛋白酶K耐受性等方面性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究。發(fā)現(xiàn)該粗蛋白的溫度耐受范圍較廣，甚至經(jīng)高溫、高壓

5、(121℃，0.1MPa)處理25min后，仍有大約77%的活性；對(duì)多種有機(jī)溶劑如甲醇、乙醚、丙酮等也表現(xiàn)出一定的耐受性，但氯仿則使蛋白活性降低大約50%;對(duì)pH的耐受范圍也較廣，在pH值4到12的范圍，具有很高的活性；對(duì)蛋白酶K的耐受性也較強(qiáng)，經(jīng)100μg/ml的蛋白酶K作用90min后，仍保持大約80%的活性。
　　 尋找具有廣譜抗真菌活性的蛋白，克隆其基因，利用基因工程的方法培育植物抗病品種或者構(gòu)建工程菌株，生產(chǎn)微生物農(nóng)藥

6、，已成為近年來生物技術(shù)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在本研究中，對(duì)從發(fā)酵液中提取的粗蛋白經(jīng)葡聚糖凝膠SephadexG-200初步純化后，將活性組分進(jìn)行質(zhì)譜檢測。經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-MS-MS)檢測分析，目的蛋白與NCBI中解淀粉芽孢桿菌FZB42的YhfE相似性較高。據(jù)此結(jié)果，我們從NK-2菌株的基因組中克隆得到了該基因，并提交GenBank(GenBank accession：HM143898)。隨后將該基因與表達(dá)載體pET-28a+)連接，