中藥有效組分配伍方劑對心肌缺血再灌注性損傷的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、本文進(jìn)行了雙參通冠方對大鼠心肌缺血再灌注性損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究，建立了SD大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎/放松法復(fù)制缺血再灌注性損傷模型。 結(jié)果：正常心肌無梗死區(qū)，缺血再灌注損傷后心肌梗死面積、梗死區(qū)重量、梗死區(qū)/心室百分率、梗死區(qū)/心臟百分率；SSTG方縮小缺血再灌注損傷心肌梗死面積、減輕梗死區(qū)重量、降低梗死區(qū)/心室(心臟)百分率，與模型組相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；正常組SOD含量與缺血再灌注后SOD兩者相比，差異具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意

2、義(P＜0.05)；SSTG方能增高缺血再灌大鼠血清SOD活性、降低MDA含量，與模型組相比差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SSTG方降低血清中CK、LDH含量，SSTG低劑量組與模型組相比差異具意義(P＜0.05)；正常組血清TNF-α、ICAM-1與PG/ml缺血再灌注損傷后二者差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SSTG方降低血清中TNF-α、ICAM-1含量，與模型組相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SSTG方降低心肌含量

3、、增高K+含量；正常心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻，肌纖維清晰，胞膜完整，無變性壞死，缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞排列紊亂，著色不均，部分心肌細(xì)胞濁腫、心肌纖維橫紋不清或消失；與模型組相比，SSTG胞膜完整，無變性壞死，缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞排列紊亂，著色不均，部分心肌細(xì)胞濁腫、心肌纖維橫紋不清或消失；與模型組相比，SSTG方處理后心肌細(xì)胞排列較整齊、著色相對均勻、水腫減輕，心肌纖維橫紋較清晰；SSTG方抑制梗死區(qū)NF-κB活化，胞核陽性表達(dá)

4、減少，下調(diào)再灌損傷心肌NF-κB陽性表達(dá)百分率、免疫反應(yīng)物斑點(diǎn)總面積、平均吸光度、面密度的顯著升高，與模型組相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SSTG方抑制Cx43降解，上調(diào)陽性表達(dá)百分率、免疫反應(yīng)物斑點(diǎn)總面積、平均灰度、面密度，與模型組相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；　　提示：雙參通冠方對缺血再灌注性損傷心肌有保護(hù)作用，其機(jī)理與其Ca2+拮抗、調(diào)節(jié)Ca2+相關(guān)信號分子的作用有關(guān)。進(jìn)而在細(xì)胞水平，對雙參通冠方藥物血清的C

5、a2+拮抗作用進(jìn)行了深入研究。 本文進(jìn)行了雙參通冠方血清藥理學(xué)與血清藥化學(xué)研究，應(yīng)用心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，進(jìn)行血清藥理學(xué)研究，確定藥物血清的制備方案；協(xié)同血清藥化學(xué)研究，尋找SSTG方及其藥物血清抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的藥理活性物質(zhì)。 方法與結(jié)果：心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型的建立培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞。缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧法復(fù)制心肌細(xì)胞缺血再灌注樣損傷模型。復(fù)氧結(jié)束后取心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將SD大鼠，連續(xù)5天灌服生理鹽水、S

6、STG90mg/kg、45mg/kg、22.5mg/kg、鹽酸地爾硫()片16mg/kg。末次給藥后30、60、90、120min腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56℃滅活30min，過濾除菌，-20℃短期保存?！　”疚倪M(jìn)行了反應(yīng)體系中藥物血清濃度(體積比)研究?！　〗Y(jié)果：藥物血清濃度為5％、10％、20％時(shí)，心肌細(xì)胞OD值依次升高，20％劑量時(shí)心肌細(xì)胞OD值與正常心肌細(xì)胞OD值相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示高濃度的藥物血清對

7、心肌細(xì)胞有危害。本實(shí)驗(yàn)選用10％的添加劑量；動(dòng)物給藥劑量并非越大，藥理效應(yīng)越強(qiáng)；藥物血清時(shí)效、量效研究確定SSTG藥物血清的最佳制備方案為：以SSTG90mg/kg、45mg/kg、22.5mg/kg的灌胃劑量，連續(xù)灌服5天，末次給藥后90min取血；SSTG藥物血清中可檢測到人參皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素，三個(gè)指征成分的血藥達(dá)峰時(shí)間為60-120min?！　⊙逅幚韺W(xué)與血清藥化學(xué)研究結(jié)果提示：人參皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙

8、索是SSTG方藥物血清抗心肌缺氧復(fù)氧損傷藥理活性物質(zhì)的指征成分。　　本文進(jìn)行了雙參通冠方藥物血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷影響的實(shí)驗(yàn)研究?！　》椒ㄅc結(jié)果：對心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[Ca2+]i的影響。　　結(jié)果：SSTG藥物血清能有效抑制缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞[Ca2+]i濃度的增加，與模型組相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；心肌細(xì)胞外液為含Ca2+液時(shí)，給予K+刺激，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，心肌細(xì)胞Ca2+基礎(chǔ)熒光值快速升高；空白血

9、清處理后100秒、200秒內(nèi)胞漿Ca2+熒光大多仍在上升；SSTG血清處理后100秒內(nèi)對胞漿Ca2+熒光的抑制率達(dá)72.94％，處理后200秒時(shí)Ca2+熒光基本回落到靜息狀態(tài)。SSTG藥物血清對K+所致細(xì)胞整體、胞核Ca2+熒光的影響變化趨勢與胞漿相近，與空白血清相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；空白血清預(yù)處理的心肌細(xì)胞胞漿Ca2+在受K+刺激后升幅為886.4U，SSTG血清預(yù)處理的胞漿Ca2+升幅為642U，SSTG藥物血清并

10、能抑制胞漿Ca2+達(dá)峰后100秒、200秒內(nèi)Ca2+的升高；細(xì)胞整體、胞核Ca2+熒光在受K+刺激后的變化趨勢與胞漿相近；心肌細(xì)胞外液為無Ca2+液時(shí)，給予Thapsigargin刺激，胞漿Ca2+熒光錘快速升高；空白血清處理后50秒、100秒胞漿Ca2+熒光仍在上升，SSTG血清處理后50秒、100秒后對胞漿Ca2+升高的抑制率分別為5.64％、76.91％；SSTG血清對Thapsigargin所致心肌細(xì)胞整體、胞核Ca2+熒光增高

11、的影響與胞漿相似，與空白血清相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；空白血清預(yù)處理后的心肌細(xì)胞在受Thapsigargin刺激后升幅為1439U，SSTG血清預(yù)處理后的胞漿Ca2+升幅為1370U,SSTG血清處理后心肌細(xì)胞胞漿Ca2+升高的終降率是空白血清處理細(xì)胞的2倍；細(xì)胞整體、胞核Ca2+熒光在受Thapsigargin刺激后的變化趨勢與胞漿相近；對Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性

12、的影響；SSTG血清能提高缺氧復(fù)氧時(shí)心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase活性，與空白血清相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；正常心肌CaM、CaMPKⅡδ低表達(dá)，CaM/GAPDH、CaMPKⅡδ/GAPDH值分別為(0.54±0.24)、(0.35±0.34)，缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞CaM、CaMPKⅡδmRNA表達(dá)增強(qiáng)，CaM/GaPDH、CaMPKⅡδ/GAPDH值為(2.10±0.58)、(2.4

13、8±0.68)，二者差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SSTG血清抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞CaM、CaMPKⅡδmRNA表達(dá)，降低CaM/GAPDH、CaMPKⅡδ/GAPDH值，與空白血清相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；未檢測到CaMPKⅡγmRNA表達(dá)；SSTG血清有效抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中T-NOS、非Ca2+依賴性iNOS活性及NO含量的增高，與空白血清相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；心肌細(xì)胞ICAM-1表達(dá)

14、由正常心肌ICAM-1表達(dá)值為(0.43±0.02)，受TNF-α、A23187刺激后，空白血清處理組的ICAM-1值分別升高到(0.50±0.05)、(0.52±0.07)，SSTG藥物血清抑制TNF-α、A23187誘導(dǎo)心肌細(xì)胞過量表達(dá)ICAM-1，與空白血清相比差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；正常心肌ICAM-1表達(dá)值為(0.52±0.08)、空白血清預(yù)處理的心肌細(xì)胞在受刺激后ICAM-1表達(dá)增高到(0.75±0.06)、(0.

15、84±0.19)，二者相比差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SSTG藥物血清預(yù)處理后的心肌細(xì)胞ICAM-1表達(dá)降低，與空白血清相比，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 提示：雙參通冠方藥物血清對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)理與其Ca2+拮抗、調(diào)節(jié)Ca2+相關(guān)信號分子的作用有關(guān)。4結(jié)論整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSTG方抗心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制與其影響心肌細(xì)胞Ca2+信號、Ca2+相關(guān)信號分子、及細(xì)胞間通訊的作用有關(guān)。SSTG方

16、能減小梗死區(qū)面積，減輕梗死區(qū)重量；升高SOD活性，降低MDA含量；抑制CK、LDH的釋放；降低心肌組織Na+、Ca2+含量、升高K+含量；抑制NF-κB的活化及的分泌；抑制Cx43的降解?！　⊥ㄟ^血清藥理學(xué)研究確定SSTG藥物血清最佳制備方案。血清藥理學(xué)與血清化學(xué)協(xié)同研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙索是SSTG方及其藥物血清抗心肌缺氧復(fù)氧損傷藥理活性物質(zhì)的指征成分?！　〖?xì)胞及分子水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSTG藥物血清抗心

17、肌缺氧復(fù)氧損傷的作用機(jī)理與其抑制缺氧復(fù)氧時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+過負(fù)荷有關(guān)。SSTG藥物血清抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的作用是通過提高Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性、抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣泵Ca2+重?cái)z而發(fā)生的。SSTG藥物血清抑制缺氧復(fù)氧時(shí)CaM及CaMPKⅡδ活性；抑制NOS-NO系統(tǒng)；抑制TNF-α、A23187誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)?！　”菊n題圍繞鈣超載，從整體與細(xì)胞水平闡明了S