脂聯(lián)素蛋白的純化方法及卵巢癌ES-2體外抑瘤活性研究.pdf

1、脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪細(xì)胞因子，由Scherer等于1995年首先從鼠的脂肪細(xì)胞分離出來，1999年Arita等將其命名為脂聯(lián)素。因為脂聯(lián)素是一種脂肪細(xì)胞因子，所以開始的研究集中于其對肥胖和糖尿病的作用方面。研究顯示脂聯(lián)素血漿濃度決定于腹部脂肪含量，脂聯(lián)素可能是聯(lián)系腹型肥胖、胰島素抵抗及致動脈粥樣硬化血脂譜的內(nèi)在因素。后來的人們發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素水平與一些腫瘤具有相關(guān)性，臨床流行病學(xué)研究資料發(fā)現(xiàn)，低脂聯(lián)素水平可獨立增加患子宮內(nèi)膜癌、乳腺

2、癌、胃癌和前列腺癌的危險性。由于脂聯(lián)素水平與多種生殖系統(tǒng)腫瘤相關(guān)，所以我們設(shè)計體外實驗來驗證脂聯(lián)素水平對卵巢癌細(xì)胞系ES-2的作用。 本實驗的目的是利用已克隆好的脂聯(lián)素基因工程菌和球形結(jié)構(gòu)域脂聯(lián)素基因工程菌大量表達(dá)目的蛋白，研究最佳的蛋白純化方法。并驗證脂聯(lián)素對卵巢癌細(xì)胞系ES-2的增殖、細(xì)胞周期以及遷移的抑制作用。 通過對表達(dá)條件的摸索，找到一個蛋白大量表達(dá)的合適條件來大量擴(kuò)增基因工程菌，對其表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。利用H

3、is標(biāo)簽與Ni<'+>的特異親和力使用His-Bind純化柱對其進(jìn)行純化，由于全長脂聯(lián)素蛋自的表達(dá)主要以可溶性蛋白形式存在，而球形結(jié)構(gòu)域脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)主要以包含體形式存在，所以我們分別對其采用不同的方法進(jìn)行純化。對全長脂聯(lián)素進(jìn)行可溶性蛋白的直接過柱純化，對球形結(jié)構(gòu)域脂聯(lián)素蛋白進(jìn)行包含體變性后的親和層析。 本研究用人脂聯(lián)素重組體進(jìn)行卵巢癌細(xì)胞系ES-2的體外抑瘤實驗。采用MTT(四唑鹽比色試驗)法測定蛋白對細(xì)胞增殖的抑制作用，劃

4、痕試驗檢驗脂聯(lián)素對細(xì)胞遷移的影響，用流式細(xì)胞儀檢測其對細(xì)胞周期的抑制。 通過實驗條件的摸索，我們大量的表達(dá)了基因工程菌，并利用Ni<'+>柱對其進(jìn)行純化得到了目的蛋白。得到的全長脂聯(lián)素蛋白和球形結(jié)構(gòu)域脂聯(lián)素蛋白濃度分別為0.51mg/ml和0.77mg/ml。 通過MTT(四唑鹽比色試驗)法測定，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞系ES-2的增殖，并且這種作用具有濃度依賴性，從而進(jìn)一步證明了脂聯(lián)素可以抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性增