hERα Tyr537Asn突變對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：研究人類雌激素受體α(hERα)Tyr537Asn突變在不加藥和加入藥物(雌二醇和4-羥化他莫昔芬)進(jìn)行處理后對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，并且我們將首次調(diào)查該位點在中國健康人群和乳腺癌人群中的突變頻率。 方法：從人肝細(xì)胞中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出hERαcDNA基因的全長。將純化的hERα cDNlA產(chǎn)物與pGEM-T載體進(jìn)行T連接，形成野生型重組克隆載體。在野生型重組克隆載體的基礎(chǔ)上應(yīng)用定點誘變的方法構(gòu)建突變

2、型重組克隆載體。用EcoR I和BamH I雙酶切hERα-pGEM-T克隆載體(野生型和突變型)，將目的片段純化后與同樣進(jìn)行過雙酶切的pcDNA3.1(-)B-myc/his進(jìn)行連接，即構(gòu)建野生型和突變型的hERα真核表達(dá)載體。利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，將構(gòu)建好的hERα野生型和突變型真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入ERα陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，用Western blot的方法檢測蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)過不同濃度不同時間的雌二醇(E2)和/或4-

3、羥化他莫昔芬(4-OHT)處理后，用MTT的方法檢測各組細(xì)胞的A490值，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞增殖率或抑制率，比較野生型和突變型組細(xì)胞增殖水平的差異。用PCR-RFLP的方法對中國人群ERαTyr537Asn(T1609A)位點進(jìn)行基因分型。 結(jié)果：成功構(gòu)建了野生型和突變型hERα真核表達(dá)載體，野生型hERα的測序結(jié)果與Genbank上的hERα CDS序列完全一致，突變型hERα真核表達(dá)載體正好在目的位點正確引入了突變。將野生

4、型和突變型hERα真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞后，Western blot結(jié)果表明兩組間的ERα蛋白表達(dá)相對值沒有顯著差異(p＞0.05)。在不加任何藥物進(jìn)行處理的情況下，突變型組的細(xì)胞存活率在24，48，72h都顯著高于野生型組(p＜0.05)。10-8M的雌二醇和10-6H，10-7M的4-羥化他莫昔芬對兩組細(xì)胞的增殖都有影響，但是兩組細(xì)胞在藥物處理下的增殖水平?jīng)]有顯著差異(p＞0.05)。10-6M的4-羥化他