人參皂苷Rg1選擇性激動(dòng)甾體激素受體抗Aβ25-35致原代皮層神經(jīng)元損傷與促胚胎干細(xì)胞衍生神經(jīng)元研究.pdf

1、胚胎干(Embryonic stem，ES)細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)并保持高度未分化狀態(tài)，而給予適宜培養(yǎng)條件后，可在體外分化為不同胚層源性的任何類(lèi)型細(xì)胞。雖然其具有分化全能性，但要應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，僅有細(xì)胞來(lái)源是不夠的，如何調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，特別是干細(xì)胞的分化命運(yùn)，才是科學(xué)界亟待解決的重大課題1，12，20。
　　 人參是著名的補(bǔ)益中藥，應(yīng)用于中醫(yī)臨床已有兩千多年的歷史，具有廣泛的藥理作用和醫(yī)療用途。近年來(lái)，大量研究已證實(shí)人參皂苷Rg

2、l是人參作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要活性成分之一，具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，但其具體作用機(jī)制迄今未明5。Rgl有類(lèi)似甾體激素的剛性甾體母核，且體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)其具有雌激素樣和糖皮質(zhì)激素樣的活性7，8。大量文獻(xiàn)報(bào)道甾體激素，如雌激素，孕激素和糖皮質(zhì)激素等，均具有顯著的神經(jīng)保護(hù)和促智作用，因此推測(cè)Rgl的神經(jīng)。保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用可能與甾體激素受體的激動(dòng)相關(guān)。本論文采用原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元和小鼠ES細(xì)胞體外分化神經(jīng)元兩個(gè)模型，深入探討了人

3、參皂苷Rgl在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)分化兩方面的活性和可能機(jī)制，為其在防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論支持。
　　 Junctophilin(JP)蛋白家族，是一類(lèi)存在于可興奮細(xì)胞中的新型膜結(jié)合蛋白，在進(jìn)化上高度保守21，其分布具有組織特異性，JP-3和JP-4屬于神經(jīng)亞型，在大腦皮層、海馬及小腦表達(dá)豐度很高18。文獻(xiàn)報(bào)道，JP-3，-4基因雙敲除的小鼠呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能失常和記憶認(rèn)知功能損傷，提示這兩種蛋白與動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和記憶功能密

4、切相關(guān)，但其在動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化及功能特征尚未見(jiàn)報(bào)道，且兩個(gè)亞型在分布和功能上的具體差異也尚未探明。本研究第三部分采用小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)細(xì)胞體系，模擬神經(jīng)的發(fā)生發(fā)育過(guò)程，考察JP-3，-4蛋白在分化所得各類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞中的的表達(dá)特征，及其在ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元過(guò)程中的作用，旨在揭示JP-3，-4在神經(jīng)分化發(fā)育過(guò)程中的生命現(xiàn)象本質(zhì)，并探尋新的促神經(jīng)再生藥物作用靶點(diǎn)。
　　 1.人參皂苷Rgl對(duì)Aβ25-35所致原

5、代大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用(該部分內(nèi)容已發(fā)表于Neuropharmacology)
　　 β淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)是在阿爾茨海默(Alzheimer's disase，AD)患者腦中發(fā)現(xiàn)的一種多肽，具有明顯的神經(jīng)毒性，目前認(rèn)為是導(dǎo)致患者神經(jīng)元變性和丟失的重要原因。本部分實(shí)驗(yàn)采用Aβ毒性片斷Aβ25-35損傷原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元的毒性模型，探討了人參皂苷Rgl對(duì)Ap25-35所致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制，

6、并明確各甾體激素受體在其中所扮演的角色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rgl能劑量依賴(lài)性地對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性，其中20μmol/L為其作用的最佳濃度。Rgl孵育可引起雌激素受體α(ERα)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)的核轉(zhuǎn)位，但對(duì)雌激素受體β(ERβ)和孕激素受體(PR)無(wú)作用，且其與ERα和GR結(jié)合的IC50分別為8.6μmol/L和12.8μmol/L，提示Rgl具有體外選擇性激動(dòng)ERα和GR的作用。siRNA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)基因沉默原代神經(jīng)元的ERα和GR，

7、可阻斷Rgl的神經(jīng)保護(hù)作用，表明Rgl的保護(hù)作用是通過(guò)選擇性活化ERα和GR實(shí)現(xiàn)的，明確了Rgl的具體作用靶點(diǎn)。
　　 Aβ可引起原代神經(jīng)元中活性氧(ROS)和NO生成，線(xiàn)粒體膜電位和ERK磷酸化下降，NF-κB激活，過(guò)氧亞硝酸根產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元蛋白酪氨酸硝基化損傷和細(xì)胞凋亡，上述損傷現(xiàn)象均可被Rgl逆轉(zhuǎn)或減輕。除了抗氧化效應(yīng)，Rgl的上述神經(jīng)保護(hù)作用均通過(guò)激動(dòng)ERα和GR，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，而其抗氧化作用可能與自身

8、的自由基清除能力相關(guān)。上述結(jié)果提示，經(jīng)由ERα和GR活化的抗酪氨酸硝基化.線(xiàn)粒體凋亡通路是Rgl神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。
　　 2.人參皂苷Rgl誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究
　　 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，某些小分子化合物能通過(guò)作用于特定靶點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，因此，新型小分子探針的發(fā)現(xiàn)將為細(xì)胞移植，體細(xì)胞重編程和干細(xì)胞分化研究帶來(lái)新的活力和希望12，20。除了上述顯著的神經(jīng)保護(hù)活性，Rgl還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞增

9、殖的作用22，23，但其是否能影響神經(jīng)分化尚未探明。本部分實(shí)驗(yàn)中，我們考察了人參皂苷Rgl促小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用，并對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了初步探索。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10μmol/L Rgl共孵育能促小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，顯著提高分化所得細(xì)胞中神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元的比例，并上調(diào)神經(jīng)標(biāo)志性蛋白的表達(dá)量。此外，免疫熒光和western blot的結(jié)果均證實(shí)ES細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體(GR)的表達(dá)呈持續(xù)上調(diào)趨勢(shì)

10、。GR拮抗劑RU486可有效抑制Rgl促神經(jīng)分化的作用。同時(shí)，Rgl還能提高ERK和Akt的磷酸化水平，且此作用也可被RU486所拮抗。為驗(yàn)證ERK與Akt是否參與Rgl的促神經(jīng)分化過(guò)程，進(jìn)一步采用MEK抑制劑U0126和P13K抑制劑LY294002，結(jié)果顯示兩者均可有效抑制Rgl的促神經(jīng)分化作用，且U0126也可一定程度抑制Akt的磷酸化水平。上述結(jié)果提示，人參皂苷Rgl具有促小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元的作用，此作用經(jīng)由GR-ME

11、K-ERK1/2-PI3K-Akt通路實(shí)現(xiàn)。
　　 3.小鼠ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元JP-3，-4的表達(dá)及功能特征研究
　　 本研究第三部分采用小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)細(xì)胞體系，模擬神經(jīng)的發(fā)生發(fā)育過(guò)程，考察JP-3，-4蛋白的表達(dá)特征，及其在ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元過(guò)程中的作用。實(shí)時(shí)定量PCR和western blot法檢測(cè)分化各階段JP-3，-4基因和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明無(wú)論是基因?qū)用孢€是蛋白層面，JP-3，-4均呈現(xiàn)先

12、上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，其中JP-3的一過(guò)性高峰出現(xiàn)在貼壁分化的第5天(d8+5)，而JP-4的高峰則在d8+0，提示兩者脈沖式的表達(dá)可能在ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞早期具有特定的生物學(xué)意義。進(jìn)一步采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)考察JP-3，-4的分布，結(jié)果顯示在分化所得的細(xì)胞類(lèi)型中包含神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，JP-3，-4雖在星型膠質(zhì)細(xì)胞中有一定程度的表達(dá)，但絕大部分存在于神經(jīng)元中。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)分化所得的神經(jīng)元中存在膽堿能神

13、經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元，JP-3，-4在這三類(lèi)亞型神經(jīng)元中的表達(dá)量也有所不同，在谷氨酸能神經(jīng)元中表達(dá)最多，膽堿能神經(jīng)元中其次，而GABA能神經(jīng)元中最少。
　　 為考察分化所得神經(jīng)元中的JP-3，-4是否具有其固有的維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的功能，進(jìn)一步對(duì)分化所得的神經(jīng)元進(jìn)行小干擾實(shí)驗(yàn)，利用活細(xì)胞工作站，動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)與JP-3，-4密切相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放過(guò)程。結(jié)果顯示si-JP-3，-4后，蘭尼堿受體增敏劑咖啡因誘發(fā)的鈣離

14、子誘導(dǎo)的鈣離子釋放(Ca2+-induced Ca2+release，CICR)過(guò)程雖存在，但明顯受到抑制，而JP-3，-4雙干擾后，CICR則被完全阻斷，提示ES分化所得神經(jīng)元中的JP-3，-4均具有其固有的維持胞內(nèi)鈣離子平衡的功能。
　　 另一方面，既然JP-3，-4在分化早期呈現(xiàn)一過(guò)性上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，且此表達(dá)高峰的時(shí)間窗基本出現(xiàn)在神經(jīng)前體細(xì)胞期，提示JP-3，-4表達(dá)可能與ES細(xì)胞的神經(jīng)分化相關(guān)。為驗(yàn)證這一假說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一

15、步采用RNA小干擾(siRNA)技術(shù)，沉默ES細(xì)胞中JP-3，-4的表達(dá)，目的在于抑制JP-3，-4的脈沖式表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)si-JP-3，-4的神經(jīng)元分化率及神經(jīng)標(biāo)志性蛋白表達(dá)量均顯著低于陰形序列對(duì)照組，且JP-4基因沉默對(duì)神經(jīng)分化的抑制作用強(qiáng)于JP-3，提示JP-3，-4在ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元過(guò)程中起到重要作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.人參皂苷Rgl具有抗Aβ25-35所致原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的作用，該作用

16、與選擇性激動(dòng)ERα和GR相關(guān)，其下游分子機(jī)制包括上調(diào)ERK磷酸化，抑制NF-κB激活，減少蛋白硝基化損傷和阻斷線(xiàn)粒體凋亡通路等。
　　 2.人參皂苷Rgl具有誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元的作用，具體作用機(jī)制與啟動(dòng)GR-MEK-ERK1/2-PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)。
　　 3.小鼠ES細(xì)胞體外分化所得神經(jīng)元表達(dá)功能性的JP-3，-4，其主要分布于谷氨酸能神經(jīng)元中，其次為膽堿能神經(jīng)元，再次為GABA能神經(jīng)元。在分化