PTEN對抗氧化蛋白調(diào)控機(jī)制及效應(yīng)研究.pdf

1、10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten，PTEN），是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有磷酸酶功能的抑癌基因，在多種腫瘤中存在突變或缺失。我們前期以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系PTEN+/+MEFs為基礎(chǔ)，成功建立了體外條件敲除PTEN基因具有惡性表型的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系PTEN-/-MEFs。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究PTEN+/+MEFs和PT

2、EN-/-MEFs細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的差異。我們發(fā)現(xiàn)在PTEN缺失MEFs細(xì)胞中同屬抗氧化防御系統(tǒng)的銅鋅-超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）以及過氧化物還原酶（Prx）5，6均表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步運(yùn)用Northern blot和Western blot對這一結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，顯示PTEN缺失MEFs細(xì)胞中Cu/Zn-SOD和Prx1，2，5，6 mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)。
　　 抗氧化防御系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（Superoxide Di

3、smutase，SOD）、過氧化物還原酶家族（Peroxiredoxins，Prxs）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）以及谷胱苷肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPxs）等，是體內(nèi)活性氧（ROS）的清除系統(tǒng)。過量的ROS會形成氧化壓力（oxidative stress），引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致DNA分子的損傷，從而引起基因組不穩(wěn)定性。正常生理情況下，人體主要依靠抗氧化防御系統(tǒng)來維持ROS的生成與清除

4、之間的動態(tài)平衡狀態(tài)。前期研究結(jié)果顯示：PTEN-/-MEFs細(xì)胞抗氧化防御能力降低；細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)ROS水平升高；細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷增強(qiáng)；細(xì)胞DNA氧化損傷增強(qiáng)。
　　 到目前為止，沒有任何關(guān)于PTEN對Cu/Zn-SOD以及Prxs表達(dá)調(diào)控機(jī)制的報(bào)道。對PTEN的功能研究顯示：PTEN具有脂磷酸酶的活性，對脂類底物3，4，5.三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）有強(qiáng)去磷酸化作用，而PIP3是PI3K/AKT。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要信號分子。P

5、TEN的缺失可引起PI3K/AKT信號級聯(lián)的活化，從而刺激細(xì)胞增殖與遷移。已知AKT可通過下游的Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子FoxOs（包括FoxO1，F(xiàn)oxO3a和FoxO4）對同屬于抗氧化防御系統(tǒng)的CAT和Mn-SOD基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。在此調(diào)控過程中，AKT對FoxOs的磷酸化可促進(jìn)FoxOs從核內(nèi)排出，繼而發(fā)生降解失活，減弱其在核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，使CAT和Mn-SOD基因轉(zhuǎn)錄水平降低。結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，

6、我們提出以下假設(shè)：PTEN可通過拮抗PI3K/AKT通路對FoxOs轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化降解途徑，進(jìn)而影響Prx1，2，5，6以及Cu/Zn-SOD的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄。
　　 基于上述假設(shè)，本研究分三部分進(jìn)行：
　　 1.PTEN是否通過：PI3K/AKT/FoxOs通路調(diào)控抗氧化防御蛋白的蛋白表達(dá)：（1）Western Blot比較PTEN+/+MEFs和PTEN-/-MEFs細(xì)胞基礎(chǔ)FoxO1、FoxO3a和FoxO4磷酸化水

7、平以初步判斷可能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。（2）Western Blot檢測PTEN+/+MEFs瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT、AKT-AC質(zhì)粒以及PTEN-/-MEFs瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT、AKT-DN質(zhì)粒，P-FoxOs和抗氧化防御蛋白的蛋白表達(dá)水平差異，確定PTEN是否通過PI3K/AKT通路影響FoxOs在核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性從而調(diào)控抗氧化防御蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步明確PTEN通過FoxOs亞家族的哪一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與對Prx1，2，5，

8、6和Cu/Zn-SOD表達(dá)的調(diào)控提供線索。
　　 2.檢測PTEN是否通過PI3K/AKT通路對細(xì)胞內(nèi)活性氧和抗氧化防御能力產(chǎn)生影響：（1）DCFtt-DA（2’7’-二氯熒光素雙乙酸鹽）和DHE（二氫乙啶）熒光探針分別標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)H2O2及O2-，結(jié)合流式細(xì)胞學(xué)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT、AKT-AC質(zhì)粒的PTEN+/+MEFs以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT、AKT-DN質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞中DCF和Eth熒光強(qiáng)度，以明確

9、PTEN是否通過AKT通路影響細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)H2O2及O2-的水平。（2）中性彗星電泳檢測PTEN-/-MEFs和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞內(nèi)不同濃度H2O2誘發(fā)的DNA DSBs水平變化，從而明確重建PTEN表達(dá)對MEFs細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御能力的影響。
　　 3.檢測PTEN是否通過P13K/AKT通路對細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生影響：（1）中性彗星電泳檢測PTEN-/-MEFs和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT質(zhì)粒

10、的PTEN-/-MEFs細(xì)胞內(nèi)DNA DSBs水平；（2）免疫熒光染色檢測0.01umol/L H2O2處理15min后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT、AKT-AC質(zhì)粒PTEN+/+MEFs以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT、AKT-DN質(zhì)粒PTEN-/-MEFs細(xì)胞按不同時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，胞核中γH2AX位點(diǎn)數(shù)（其直接反映DNA DSBs位點(diǎn)數(shù)），從而明確PTEN是否通過AKT通路對細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂水平產(chǎn)生影響。
　　 主要結(jié)果如下：

11、　　 1.PTEN通過PI3K/AKT通路的活化抑制調(diào)控Prx1，2，5，6及Cu/Zn-SOD的蛋白表達(dá)：Western Blot結(jié)果顯示瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT、AKT-AC質(zhì)粒的PTEN+/+MEFs細(xì)胞中Prx1，2，5，6和Cu/Zn-SOD蛋白水平明顯下調(diào)，說明在PI3K/AKT通路失活的PTEN+/+MEFs中，活化AKT可下調(diào)抗氧化防御蛋白的表達(dá)。瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT/AKT-DN質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs

12、中Prx1，2，5，6和Cu/Zn-SOD蛋白水平上調(diào)，說明在PTEN缺失細(xì)胞中抑制AKT可使抗氧化防御蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。以上結(jié)果表示PTEN可通過拮抗PI3K/AKT通路調(diào)控Prx1，2，5，6及Cu/Zn-SOD蛋白表達(dá)。
　　 2.PTEN通過拮抗PI3K/AKT通路抑制轉(zhuǎn)錄因子FoxO1磷酸化：Western blot結(jié)果顯示PTEN缺失細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子FoxO1和FoxO3a磷酸化水平升高，提示FoxO1和FoxO3a可能

13、參與PTEN對抗氧化防御蛋白的調(diào)控；Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT/AKT-AC質(zhì)粒的PTEN+/+MEFs和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT/AKT-DN質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞中P-FoxO1蛋白表達(dá)，結(jié)果表明AKT活化后的PTEN+/+MEFs細(xì)胞P-FoxO1蛋白表達(dá)增高，AKT抑制后的PTEN-/-MEFs細(xì)胞P.FoxO1蛋白表達(dá)顯著降低，說明PTEN可通過拮抗PI3K/AKT通路抑制下游轉(zhuǎn)錄因子Fox01磷

14、酸化，維持FoxO1在核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。
　　 3.PTEN通過抑制PI3K/AKT通路降低細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)ROS水平：運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測DCFH-DA和DHE探針標(biāo)記穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT/AKT-AC質(zhì)粒的PTEN+/+MEFs以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT/AKT-DN質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞內(nèi)DCF和Eth熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示AKT活化后的PTEN+/+MEFs細(xì)胞內(nèi)DCF和Eth熒光強(qiáng)度明顯增高，AKT抑制后的PTEN-/

15、-MEFs細(xì)胞內(nèi)DCF和Eth熒光強(qiáng)度則顯著降低。說明PTEN可通過抑制PI3K/AKT通路降低細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)ROS水平。
　　 4.PTEN再表達(dá)引起細(xì)胞抗氧化防御能力增強(qiáng)：運(yùn)用中性單細(xì)胞凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)0.01 mmol/L H2O2作用PTEN-/-MEFs細(xì)胞就出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的平均尾力矩增長，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞則在0.05 mmol/L H2O2作用時(shí)才出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的平均尾力矩增

16、長。說明PTEN再表達(dá)抑制PI3K/AKT通路會引起MEFs細(xì)胞的抗氧化防御能力明顯增強(qiáng)。
　　 5.PTEN通過拮抗PI3K/AKT通路減少細(xì)胞內(nèi)DNA DSBs水平：中性彗星電泳檢測PTEN-/-MEFs和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞，顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN-WT質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞的平均尾力矩（20.34）明顯低于PTEN-/-MEFs細(xì)胞（27.23）。說明PTEN再表達(dá)可顯著降低細(xì)胞

17、內(nèi)DNA DSt3s水平。0.01umol/L H2O2作用15min后按不同時(shí)間培養(yǎng)，免疫熒光染色顯示PTEN+/+MEFs細(xì)胞中γH2AX位點(diǎn)數(shù)在30min時(shí)即出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT-WT/AKT-AC質(zhì)粒的PTEN+/+MEFs細(xì)胞則在4h才出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低。PTEN-/-MEFs細(xì)胞中γH2AX位點(diǎn)數(shù)在4h出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN.WT/AKT-DN質(zhì)粒的PTEN-/-MEFs細(xì)胞在4h

18、時(shí)出現(xiàn)顯著的降低。說明PTEN通過拮抗P13K/AKT通路促進(jìn)DNA DSBs損傷的修復(fù)，并由此維持基因組穩(wěn)定性。
　　 結(jié)論如下：
　　 1.PTEN通過PI3K/AKT/FoxOs通路調(diào)控Prx1，2，5，6及Cu/Zn-SOD蛋白表達(dá)；
　　 2.PTEN通過拮抗PI3K/AKT通路降低細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)ROS水平，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力，減少細(xì)胞DNA DSBs損傷水平。說明PTEN在保護(hù)細(xì)胞免于氧化損傷、維持