層層自組裝肝素-膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體促進小口徑ePTFE人工血管內(nèi)皮化的實驗研究.pdf

1、第一部分層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的制備
　　目的：研究層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的制備過程及表面修飾涂層的穩(wěn)定性，探討制備優(yōu)良涂層效果的可行性。
　　方法：采用層層靜電組裝的方法將帶負電荷的肝素與帶正電荷的膠原交替涂覆到小口徑ePTFE人工血管上，隨后在其表面接枝CD133抗體，制備成功能性人工血管。采用掃描電鏡，紅外光譜儀評價制備過程

2、中涂層的變化，激光共聚焦顯微鏡觀察CD133抗體在涂層表面的接枝情況，接觸角測試儀檢測ePTFE血管材料表面修飾后親水性的改變。使用脫色搖床將肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體的ePTFE人工血管材料置入PBS溶液中洗滌2h，6h，12h，24 h，48h，采用激光共聚焦顯微鏡觀察各個時間點ePTFE人工血管材料表面CD133抗體熒光強度變化。
　　結(jié)果：掃描電鏡觀察結(jié)果示經(jīng)過肝素/膠原溶液反復(fù)處理后的ePTFE血管材料表面可見

3、一層膜狀物，即肝素/膠原復(fù)合電解質(zhì)膜;紅外光譜儀探測曲線的改變及肝素膠原特征性波峰的出現(xiàn)提示經(jīng)過肝素/膠原溶液反復(fù)交替處理后，涂層的厚度在增加;激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示ePTFE血管材料表面有較強的PE標記的紅色熒光信號，證實了ePTFE復(fù)合涂層血管材料表面CD133抗體接枝成功。ePTFE血管材料經(jīng)過表面涂層修飾后接觸角測試結(jié)果顯示由127.24度降至106.86度，提示涂層修飾后的血管親水性增加。肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133

4、抗體的ePTFE人工血管材料經(jīng)過PBS溶液洗滌2h，6h，12h，24 h，48 h，后，激光共聚焦顯微鏡仍然可以觀察到較強的紅色熒光信號，提示ePTFE人工血管材料表面涂層穩(wěn)定，CD133抗體接枝效果良好。
　　結(jié)論：層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的制備過程是可行的，且功能性涂層效果良好。
　　第二部分層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的體外實驗研

5、究
　　目的：研究層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管材料的抗凝血性能，血液相容性及生物相容性。
　　方法：采用層層靜電自組裝的方法將帶負電荷的肝素與帶正電荷的膠原交替涂覆到小口徑ePTFE人工血管材料上，隨后在其表面接枝CD133抗體，制備成復(fù)合涂層人工血管。參照ISO10993及GB/T16886標準中相關(guān)實驗方法行血小板粘附實驗，溶血實驗，血漿復(fù)鈣時間實驗和APTT、PT、TT測試，評

6、價復(fù)合涂層人工血管的血液相容性，同時對表面復(fù)合涂層修飾后的血管材料行大白鼠短期皮下植入實驗，細胞粘附實驗，CCK-8和LDH釋放實驗，評價復(fù)合涂層修飾人工血管的生物相容性。
　　結(jié)果：掃描電鏡檢測觀察到底物ePTFE人工血管材料表面有大量血小板黏附，血小板呈扁平狀貼覆在材料表面，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE血管材料表面有少量血小板貼覆(p＜0.05);肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體

7、的ePTFE血管材料及底物ePTFE血管材料的溶血率分別為1.56％，0.71％和2.41％，均小于5％，符合材料溶血性要求;底物ePTFE血管材料的血漿復(fù)鈣時間為510±137.5 s，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE血管材料觀察至30 min未見纖維蛋白絲。肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE血管材料的APTT、PT、TT較底物ePTFE血管材料有了較大幅度提高。大白鼠短期皮下植入

8、實驗提示表面復(fù)合涂層修飾后的ePTFE人工血管材料周圍組織炎癥反應(yīng)較未處理的ePTFE人工血管稍輕，但無明顯差異。細胞粘附實驗提示經(jīng)肝素膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE人工血管材料表面細胞生長良好，不影響細胞的粘附性。CCK-8細胞毒性實驗和LDH釋放實驗結(jié)果提示本實驗中所使用的涂層制備材料肝素、膠原及CD133抗體對細胞的增殖活力無顯著影響且無毒性，生物相容性良好。
　　結(jié)論：層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接

9、枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管材料具有良好抗凝血性能，血液相容性及生物相容性。
　　第三部分實驗豬頸動脈及股動脈小口徑人工血管移植模型的比較
　　目的：比較實驗豬頸動脈及股動脈小口徑人工血管移植模型的優(yōu)缺點。
　　方法：12只健康實驗豬，共進行頸動脈小口徑人工血管移植12次，股動脈小口徑人工血管移植4次。從頸動脈及股動脈血管的解剖，術(shù)中血管吻合操作的難易以及模型是否有利于評價術(shù)后移植血管通暢等發(fā)面比較頸動脈及

10、股動脈人工血管移植模型的優(yōu)缺點。
　　結(jié)果：從血管解剖角度講，頸動脈位置較深，吻合操作較困難，但血管管徑較粗，且分支少。股動脈較頸動脈位置表淺，更容易定位分離，術(shù)中操作易于暴露，吻合較為容易，但血管穿支血管較多，容易損傷出血。頸動脈和股動脈小口徑人工血管移植模型中，當(dāng)人工血管發(fā)生血栓形成時，實驗豬術(shù)后均未能觀察到異常臨床表現(xiàn)，術(shù)后臨床觀察不能幫助準確判斷移植血管通暢與否。
　　結(jié)論：實驗豬頸動脈及股動脈人工血管移植模型的建立

11、均具有可行性，但二者各有利弊，均可以作為研究小口徑人工血管的動物模型。
　　第四部分肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體促進6mm口徑ePTFE人工血管內(nèi)皮化的研究
　　目的：諸多研究表明早期快速內(nèi)皮化可以一定程度上提高移植人工血管的通暢率。本節(jié)研究肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體是否可以促進6mm口徑ePTFE人工血管快速內(nèi)皮化。
　　方法：采用的動物模型包括豬頸動脈血管移植模型及股動脈血管移植模型兩種。納入本組

12、研究的健康實驗豬4只，共進行血管移植模型建立8次。植入的底物ePTFE血管2根，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體的ePTFE人工血管3根，接枝CD34抗體的ePTFE人工血管3根。采用血管彩超或CTA檢測移植血管的通惕情況及近心端和遠心端吻合口形態(tài)，直徑及流速。基于計算機的流體力學(xué)分析軟件體外模擬移植血管的局部血流動力學(xué)情況，分析6 mm口徑ePTFE人工血管局部血流動力學(xué)特點。手術(shù)后飼養(yǎng)7天，對實驗動物進行取材，進行大體標本觀察，

13、掃描電鏡觀察植入的人工血管表面形態(tài)，同期進行組織病理學(xué)分析及vWF免疫組化染色，觀察移植血管表面有無內(nèi)皮形成。
　　結(jié)果：移植的6mm口徑ePTFE人工血管通暢率達100％。術(shù)后即刻血管彩超及CTA檢查提示血管吻合口形態(tài)良好，無明顯狹窄?；谟嬎銠C的流體力學(xué)分析結(jié)果提示6姍口徑ePTFE人工血管對局部血流動力學(xué)影響較小，移植血管局部壓力、切應(yīng)力、血流流線良好。大體標本觀察示肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體和接枝CD34抗體的e

14、PTFE人工血管腔面較為光亮，裸ePTFE人工血管較為粗糙，少量附壁血栓形成。組織病理學(xué)分析示接枝CD133抗體和接枝CD34抗體的修飾的血管表面較裸血管表面有膜狀物形成，vWF染色結(jié)果顯示陽性明顯。掃描電鏡結(jié)果提示接枝CD133抗體的血管表面較多內(nèi)皮細胞附著，接枝CD34抗體的血管次之，底物血管材料表面最少。
　　結(jié)論：肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體進行表面修飾ePTFE人工血管可以促進人工血管快速內(nèi)皮化，其抗血栓形成能力

15、尚需進一步評估。
　　第五部分肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體4mm小口徑ePTFE人工血管血栓形成的原因分析
　　目的：直徑4mm的小口徑ePTFE人工血管由于容易發(fā)生血栓形成而導(dǎo)致移植血管堵塞，迄今為止尚未得到有效解決。該部分擬對4 mm小口徑ePTFE人工血管發(fā)生血栓形成的原因作一分析。
　　方法：采用的動物模型包括實驗豬頸動脈血管移植模型及股動脈血管移植模型。本組研究采用實驗豬12只，共進行血管移植16次（

16、頸動脈血管移植12次，股動脈血管移植4次），植入肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體ePTFE人工血管6根，肝素/膠原復(fù)合涂層ePTFE人工血管4根，底物ePTFE人工血管3根，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD34抗體ePTFE人工血管3根。術(shù)后采用血管彩超對移植血管近心端及遠心端吻合口形態(tài)，吻合口直徑和吻合口流速進行檢測，采用CTA對實驗豬主動脈弓及弓上血管重建，觀察植入血管的整體形態(tài)。采用CAST-Ⅰ型體外血栓模擬儀和血液粘度計對實驗豬的

17、血液理化性質(zhì)進行檢測。基于計算機流體力學(xué)分析軟件模擬移植血管的局部血流動力學(xué)情況，分析局部血流動力學(xué)改變在小口徑ePTFE人工血管血栓形成中的意義。術(shù)后飼養(yǎng)7天，對實驗豬進行取材，觀察植入人工血管的大體形態(tài)，同時對人工血管進行組織病理學(xué)分析及vWF免疫組化染色，觀察移植的人工血管表面有無內(nèi)皮形成。
　　結(jié)果：移植的小口徑ePTFE人工血管整體血栓堵塞率高達87.5％。CAST-Ⅰ體外血栓模擬儀和血液粘度計檢測結(jié)果提示納入研究的實驗

18、豬不存在容易導(dǎo)致血栓形成的血液方面的異常因素?；谟嬎銠C流體力學(xué)分析結(jié)果提示ePTFE人工血管自身彈性較差，不能隨血液壓力變化發(fā)生容受性擴張，植入的人工血管形成較明顯的縮窄管，可以導(dǎo)致近心端及遠心端吻合口附近血液流體力學(xué)紊亂。大體標本觀察示發(fā)生血栓形成的標本，吻合口近心端及遠心端均有血栓形成，血管仍然通暢的標本表面亦有少量附壁血栓形成。組織病理學(xué)分析及vWF染色結(jié)果顯示三組人工血管表面均有不同程度的內(nèi)皮細胞覆蓋，提示發(fā)生血栓形成前ePT