天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生的微顆粒在肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征之一,也是臨床惡性腫瘤患者死亡的首要因素。但是,腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不十分清楚。傳統(tǒng)細(xì)胞融合理論認(rèn)為腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞相互融合形成轉(zhuǎn)移細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞從而被賦予了白細(xì)胞的移行能力。近年來研究證明,白細(xì)胞釋放的微顆粒作為一種新的信息傳遞物質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的相互融合參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制。另外,腫瘤細(xì)胞在繼發(fā)部位形成轉(zhuǎn)移瘤與白細(xì)胞募集到炎癥部位的過程都需要黏附分子所介導(dǎo)的細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間黏附作用

2、。白細(xì)胞整合素亞家族成員,如αLβ2和αMβ2是參與白細(xì)胞黏附的重要分子,肝癌細(xì)胞能否利用這些黏附分子介導(dǎo)其轉(zhuǎn)移的發(fā)生尚不清楚。本研究檢測了免疫細(xì)胞產(chǎn)生的微顆粒及其攜帶的黏附分子表型在肝癌細(xì)胞表達(dá),進(jìn)一步通過細(xì)胞和動物模型探索了肝癌細(xì)胞通過微顆粒途徑獲得黏附分子并介導(dǎo)其侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法：
　　1.免疫細(xì)胞微顆粒的制備和檢測
　　BALB/c來源的脾細(xì)胞用50ng/mlPMA刺激12h后將脾細(xì)胞懸液超速200

3、00g×60min離心所得沉淀洗1次后重懸至PBS緩沖液,流式細(xì)胞術(shù)和雙光子共聚焦顯微鏡成像技術(shù)檢測微顆粒的大小和數(shù)量。
　　2.微顆粒和負(fù)載微顆粒的肝癌細(xì)胞表面免疫分子的檢測
　　將微顆粒懸液和腫瘤細(xì)胞共孵育20h后PBS緩沖液輕柔洗2次,所得沉淀即是融合有微顆粒的腫瘤細(xì)胞。將微顆粒和負(fù)載微顆粒的H22融合細(xì)胞分別用熒光抗體4℃染色30min,PBS緩沖液洗3次離心后將微顆粒和細(xì)胞沉淀分別加入300μl PBS緩沖液重懸,

4、行流式細(xì)胞術(shù)檢測和分析。
　　3.趨化實(shí)驗(yàn)
　　趨化實(shí)驗(yàn)采用8-μm孔徑的24孔Trans-well板進(jìn)行。將25μl配制好的基底膠(5μg in10μl serum-free RPMI1640)滴入孔板上室,使其完全覆蓋上室底部形成薄膜并置于37℃溫箱孵育過夜。小室上層加入200μl細(xì)胞懸液,下層加入600μl含20％FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基。Trans-well板在37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中孵育20h后,對趨化

5、的細(xì)胞染色并顯微鏡下計(jì)數(shù)。
　　4.動物實(shí)驗(yàn)
　　本實(shí)驗(yàn)所選擇的動物為6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。將不同處理組的微顆粒分別和H22細(xì)胞共同孵育20h制備融合細(xì)胞,取一等份融合H22細(xì)胞加入20μg/ml抗CD18或CD11b中和性抗體,繼續(xù)孵育4h阻斷CD18或CD11b的表達(dá),封閉后細(xì)胞沉淀重懸于0.9％的生理鹽水中備用。每只小鼠尾靜脈注射3×105H22細(xì)胞,封閉組小鼠注射細(xì)胞4h后按照30μg/只補(bǔ)充注射CD18

6、或CD11b中和性抗體1次,各組小鼠飼養(yǎng)70天左右并觀察成瘤情況。
　　結(jié)果：
　　1.PMA活化的免疫細(xì)胞釋放微顆粒
　　采用50ng/ml的PMA刺激BALB/c小鼠脾臟來源的免疫細(xì)胞12h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清低溫超速離心獲得沉淀并重懸于PBS緩沖液中,流式細(xì)胞術(shù)檢測微顆粒的大小和數(shù)量。結(jié)果顯示免疫細(xì)胞經(jīng)過PMA刺激活化后可釋放微顆粒,且PMA活化細(xì)胞釋放的微顆粒約為未活化細(xì)胞釋放微顆粒的6倍。雙光子共聚焦顯微鏡成像技

7、術(shù)觀測微顆粒的直徑均小于1μm。
　　2.免疫細(xì)胞產(chǎn)生的微顆粒表型的表達(dá)
　　對微顆粒進(jìn)行免疫細(xì)胞特異性標(biāo)志物的熒光抗體染色。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示PMA處理組的微顆粒,其CD3和CD19分子的表達(dá)輕微增加,而Gr-1和F4/80分子的表達(dá)增加較為顯著。提示微顆粒攜帶有其母細(xì)胞來源的多種表型分子,且相對于T細(xì)胞或B細(xì)胞而言,在PMA刺激下以髓性細(xì)胞產(chǎn)生的微顆粒為主。
　　3.肝癌細(xì)胞可攝取免疫細(xì)胞產(chǎn)生的微顆粒并表達(dá)其表型

8、
　　將微顆粒和H22細(xì)胞共同孵育20h后行H22細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示H22細(xì)胞表面不同程度的表達(dá)微顆粒來源的免疫表型,如CD19、Gr-1、F4/80、CD3和MHC-II分子。提示免疫細(xì)胞通過微顆粒途徑可將其免疫學(xué)表型轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞,從而賦予腫瘤細(xì)胞新的免疫表型。
　　4.免疫細(xì)胞活化產(chǎn)生的微顆粒對H22細(xì)胞趨化性的影響
　　為了探索腫瘤細(xì)胞在獲得新表型后生物學(xué)功能的改變,采用趨化實(shí)驗(yàn)檢測H2

9、2細(xì)胞的能動性和侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果可見control-MP-H22組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)較未處理組有少量增加,而PMA-MP-H22組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)較control-MP-H22組顯著增加。
　　為了進(jìn)一步證明H22細(xì)胞在獲得免疫細(xì)胞來源的表型后其在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)功能,設(shè)計(jì)了BALB/c小鼠體內(nèi)檢測模型。各組小鼠尾靜脈注射細(xì)胞后持續(xù)觀察70天左右,期間發(fā)現(xiàn)PMA-MP-H22細(xì)胞注射組的小鼠在軀體不同部位長出腫瘤,繼而死亡。c

10、ontrol-MP-H22組有1只小鼠長出腫瘤,而未處理H22細(xì)胞組小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長,并且PMA-MP-H22細(xì)胞組小鼠生存期明顯短于未處理H22細(xì)胞組小鼠。
　　5.CD11b/CD18通過微顆粒途徑介導(dǎo)H22細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　將負(fù)載有微顆粒的腫瘤細(xì)胞和中和性CD11b或CD18抗體分別孵育檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見阻斷CD11b或CD18的表達(dá)后,H22細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力較阻斷前明顯減弱。各組小鼠

11、尾靜脈注射細(xì)胞后持續(xù)觀察70天左右。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMA-MP-H22細(xì)胞注射組小鼠在不同時間段分別長出腫瘤,且部位隨機(jī),而未處理H22細(xì)胞注射組小鼠未發(fā)現(xiàn)有腫瘤生長。另外,CD11b或CD18分子阻斷組小鼠分別有1只和2只小鼠長出腫瘤。各處理組小鼠生存曲線可見PMA-MP-H22細(xì)胞組小鼠生存期明顯短于未處理H22細(xì)胞組。而CD11b或CD18分子阻斷組小鼠生存期較之PMA-MP-H22細(xì)胞注射組有所延長。以上結(jié)果說明,H22細(xì)胞經(jīng)過PMA

12、-MP處理后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng),而當(dāng)阻斷黏附分子CD11b或CD18的表達(dá)后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力則明顯減弱。
　　6.天然免疫細(xì)胞來源的微顆粒對H22細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響
　　為了證明免疫細(xì)胞的哪一亞群產(chǎn)生的微顆粒促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,將BALB/c小鼠脾臟的免疫細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選后獲得T細(xì)胞、B細(xì)胞和不含有T、B細(xì)胞(天然免疫細(xì)胞)的三組細(xì)胞,將各組細(xì)胞 PMA刺激活化12h和H22細(xì)胞共孵育20h后分別加入Trans

13、-well孔板上室,計(jì)數(shù)移動至下室的細(xì)胞。趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B-MP和T-MP處理組遷移至下室的細(xì)胞較未處理稍有增加,而innate-MP處理組遷移至下室的細(xì)胞較未處理組顯著增加,提示天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生的微顆粒在促進(jìn)H22細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。
　　7.TIL產(chǎn)生的微顆粒對肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響
　　采用凍融上清刺激TIL活化產(chǎn)生微顆粒,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示 FTS活化刺激TIL后產(chǎn)生的微顆粒,其CD11b/CD1

14、8分子的表達(dá)較未刺激組不同程度的增加。進(jìn)一步將微顆粒和H22細(xì)胞共同孵育20h,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示H22細(xì)胞表面不同程度的表達(dá)微顆粒所攜帶的整合素分子CD11b/CD18。采用趨化實(shí)驗(yàn)檢測H22細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力結(jié)果可見,rest TIL-MP組遷移至下室的細(xì)胞較未處理組有少量增加,FTS-TIL-MP組遷移至下室的細(xì)胞較rest TIL-MP組增加。當(dāng)阻斷CD11b或CD18分子的表達(dá)后,H22細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力較阻斷前明顯減弱。最

15、后,設(shè)計(jì)BALB/c小鼠體內(nèi)檢測模型進(jìn)一步證明,各組小鼠尾靜脈注射細(xì)胞后持續(xù)觀察70天左右,發(fā)現(xiàn)FTS-TIL-MP組小鼠在不同時間段軀體不同部位長出腫瘤,繼而死亡,rest TIL-MP組和未處理H22細(xì)胞組小鼠則未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長,CD11b或CD18分子阻斷組分別有1只和3只小鼠長出腫瘤。觀測各組小鼠的生存期結(jié)果顯示FTS-MP-H22注射組小鼠生存期明顯短于未處理H22細(xì)胞注射組小鼠,而CD11b或CD18阻斷組小鼠生存期較之FTS

16、-MP-H22注射組小鼠生存期有所延長。以上結(jié)果說明,H22細(xì)胞經(jīng)過FTS-TIL-MP處理后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),而當(dāng)阻斷整合素CD11b或CD18分子的表達(dá)后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。
　　結(jié)論：本課題研究證明免疫細(xì)胞來源的微顆粒可以被腫瘤細(xì)胞所攝取,使腫瘤細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞的生物學(xué)特性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。趨化實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)封閉實(shí)驗(yàn)證實(shí)整合素CD11b/CD18分子在微顆粒途徑介導(dǎo)H22細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起一定作用,微顆粒通過轉(zhuǎn)運(yùn)