人β-防御素2在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其基因轉(zhuǎn)染治療大鼠模型的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是一種常見(jiàn)的婦科疾病，是指具有生物活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的身體其他部位。EMS雖為良性疾病，但卻有著與惡性腫瘤相似的某些生物學(xué)特性。雖其發(fā)病機(jī)理尚未完全明了，但目前大量的臨床和基礎(chǔ)研究顯示，EMS與免疫炎癥反應(yīng)和血管生成有著密切的關(guān)系，其中腹腔內(nèi)的免疫細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6、TNFα、VEGF等)的含量及活性改變被認(rèn)為是EMS發(fā)生的主要分子基礎(chǔ)；而且，以VEGF等

2、血管調(diào)控因子介導(dǎo)的血管生成是其發(fā)展的必要環(huán)節(jié)。人β-防御素2(humanβdefensin，hBD-2)是一種內(nèi)源性抗菌肽，存在于包括生殖器官在內(nèi)的各種粘膜上皮組織中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著重要作用，是聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁。已證實(shí)其具有抗病原微生物、抗感染和抗腫瘤血管生成的作用。體外研究表明，炎癥細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6、TNFα等)能誘導(dǎo)并上調(diào)hBD-2的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hBD-2的過(guò)度表達(dá)又可以抑制I

3、L-1β、IL-6、TNFα和VEGF的生成。這些研究提示hBD-2可能具有抗免疫炎癥反應(yīng)及抗血管生成的作用。既往許多研究已經(jīng)揭示了EMS的發(fā)病機(jī)制與免疫炎癥反應(yīng)及血管生成有關(guān)，那么，hBD-2是否也能通過(guò)抗免疫炎癥反應(yīng)及抗血管生成的作用抑制EMS的發(fā)生和發(fā)展呢?迄今為止，hBD-2與EMS的關(guān)系如何、其在人EMS在位及異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其作用如何等問(wèn)題，均尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究首先檢測(cè)EMS和子宮腺肌病(adenomyosis

4、，AM)患者異位和在位內(nèi)膜組織中hBD-2的基因和蛋白表達(dá)情況，并研究其表達(dá)與炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性。然后，建立EMS大鼠模型，并構(gòu)建hBD-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒，觀察hBD-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)EMS的影響，從而探討其對(duì)EMS的作用及機(jī)制。本文從以下三個(gè)部分進(jìn)行了研究。
　　 第一章人β-防御素2在人子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病組織中的表達(dá)。
　　 目的：檢測(cè)EMS和AM患者的異位和在位內(nèi)膜組織以及正常子宮內(nèi)膜組織中hBD-2的

5、基因和蛋白表達(dá)水平，了解hBD-2在EMS和AM發(fā)病中的作用。
　　 方法：選擇EMS(卵巢異位囊腫)、AM和對(duì)照組患者各25例。分為EMS異位內(nèi)膜組(EMS患者卵巢異位囊腫壁組織)、EMS在位內(nèi)膜組(EMS患者子宮內(nèi)膜組織)、AM異位內(nèi)膜組(AM患者肌壁間異位病灶組織)、AM在位內(nèi)膜組(AM患者子宮內(nèi)膜組織)和對(duì)照組(正常子宮內(nèi)膜組織)。首先采用Real-time PCR檢測(cè)各組內(nèi)膜組織中hBD-2、IL-1β、IL-6、TN

6、Fα和NF-κB的的mRNA表達(dá)水平，分析它們分別在EMS異位和在位內(nèi)膜組織中、AM異位和在位內(nèi)膜組織中的的mRNA表達(dá)水平的差異，和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平差異，以及EMS不同臨床分期中異位和在位內(nèi)膜組織中hBD-2的的mRNA表達(dá)水平的差異，同時(shí)分析hBD-2與IL-1β、IL-6、TNFα和NF-κB的的mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。然后采用Western-blot進(jìn)一步檢測(cè)各組組織中hBD-2的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：各

7、組內(nèi)膜組織中均存在hBD-2的mRNA和蛋白表達(dá)。hBD-2在EMS異位內(nèi)膜組、EMS異位內(nèi)膜組、AM異位內(nèi)膜組、AM在位內(nèi)膜組和對(duì)照組的內(nèi)膜組織中的的mRNA表達(dá)水平(中位數(shù))分別為：0.3684、0.0343、0.0320、0.0530和0.0034；蛋白表達(dá)水平(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為：1.360±0.331、0.783±0.250、0.963±0.241、0.891±0.195和0.746±0.223。將各組內(nèi)膜組織中hBD-2的

8、mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較，EMS異位內(nèi)膜組顯著高于在位內(nèi)膜組和對(duì)照組(P＜0.05)，AM異位內(nèi)膜組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。EMS和AM在位內(nèi)膜組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。將EMS不同臨床分期的異位內(nèi)膜組織中hBD-2的的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，Ⅰ期與Ⅱ期顯著高于Ⅲ期與Ⅳ期(P＜0.05)。EMS異位內(nèi)膜中hBD-2與NF-kB、TNF-α、IL-1β的的mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)性(P＜0.05)。
　

9、　 第二章攜帶人β-防御素2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其鑒定。
　　 目的：構(gòu)建hBD-2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。
　　 方法：選擇hBD-2為目標(biāo)基因，以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移工具，采用雙酶切定位定向克隆技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒PLXSN-hBD2，將其導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌擴(kuò)增，PCR電泳鑒定雙酶切正確。
　　 結(jié)果：采用基因測(cè)序的方法鑒定構(gòu)建hBD-2重組質(zhì)粒(PLXSN-hBD2)成功。
　　 第三章人β-防

10、御素2基因轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜異位癥SD大鼠模型的療效觀察。
　　 目的：觀察hBD-2基因轉(zhuǎn)染EMS大鼠模型后的治療效果，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)理。
　　 第一節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥SD大鼠模型的建立。
　　 方法：采用自體子宮內(nèi)膜移植法建立EMS的SD大鼠模型。
　　 結(jié)果：選取同時(shí)有2個(gè)成模病灶的大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　 第二節(jié)人β-防御素2基因轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型。
　　 方法：預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別在

11、大鼠異位病灶局部多點(diǎn)注射2μg和0.2μg重組質(zhì)粒pLXSN-hBD2進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，2天后PCR、Western-blot檢測(cè)異位病灶組織內(nèi)基因組DNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)染整合的鑒定。同時(shí)觀察兩種劑量轉(zhuǎn)染后2、7、14天異位病灶組織中hBD-2的蛋白表達(dá)變化，以確定療效觀察中重組質(zhì)粒的用藥劑量和時(shí)間。
　　 結(jié)果：局部多點(diǎn)注射重組質(zhì)粒pLXSN-hBD2能將hBD-2基因成功轉(zhuǎn)染到大鼠模型異位病灶組織中。選擇兩周一次，每

12、次每個(gè)病灶2μg重組質(zhì)粒治療EMS大鼠模型。
　　 第三節(jié)人β-防御素2基因轉(zhuǎn)染大鼠EMS模型的療效觀察。
　　 方法：⑴選取實(shí)驗(yàn)對(duì)象大鼠31只，隨機(jī)分為PLXSN-hBD2轉(zhuǎn)染組(11只)、PLXSN載體對(duì)照組(10只)和PBS空白對(duì)照組(10只)三組。⑵觀察三組轉(zhuǎn)染前后異位病灶的體積變化。采用免疫組化、Real-time PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后異位病灶組織中微血管密度(MVD)的變化和IL-1β、TNF-α、NF-kB

13、的mRNA表達(dá)水平。⑶利用光鏡和電鏡觀察轉(zhuǎn)染后異位病灶的組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變。⑷ELISA(酶標(biāo)法)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后大鼠血清中VEGF的水平，放免法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后大鼠血清中卵巢激素(E2、P、FSH、LH)水平的變化。
　　 結(jié)果：①轉(zhuǎn)染后2周，PLXSN-hBD2組異位病灶體積明顯小于PLXSN組和PBS對(duì)照組(p＜0.01)，小于用藥前病灶體積(p＜0.01)。PLXSN-hBD2組MVD明顯低于兩對(duì)照組(P＜0.01)，IL-

14、1β、TNF-α和NF-kBmRNA的表達(dá)也顯著低于兩對(duì)照組(p＜0.05)。②轉(zhuǎn)染后2周，PLXSN-hBD2組異位內(nèi)膜組織中，光鏡下可見(jiàn)內(nèi)膜腺體明顯減少，腺腔狹窄，細(xì)胞稀疏，呈萎縮狀態(tài)；電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞萎縮，細(xì)胞核固縮，絨毛基本消失，線粒體腫脹等現(xiàn)象。兩對(duì)照組光鏡下可見(jiàn)腺體豐富，增生明顯，腺上皮細(xì)胞排列整齊，周圍血管豐富；電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)大小正常，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，微絨毛密集，細(xì)胞器正常。③轉(zhuǎn)染后2周，PLXSN-hBD2組血清VEG