MARCCT-1在腎透明細胞癌中的表達以及對人腎癌細胞株A498生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，僅次于膀胱癌，占成人所有惡性腫瘤的2％-～3％，其病理分型以腎透明細胞癌(clearrenal cellcarcinoma，ccRCC)多見，占70％～80％左右。腎癌的發(fā)病率和死亡率在過去的50年中持續(xù)上升。腎癌侵襲轉(zhuǎn)移能力較強，術后復發(fā)率高，轉(zhuǎn)移性腎癌預后差，因此，研究RCC侵襲轉(zhuǎn)移的機制，篩選出反映R

2、CC侵襲轉(zhuǎn)移及預后的腫瘤標志物，對于RCC患者的治療和預后評估均具有重大意義。目前已經(jīng)有多個研究證實lncRNA與腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、復發(fā)密切相關，并找到了部分腫瘤特異性lncRNAs，因此，我們推測在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中很可能存在相關的lncRNAs，而lncRNAs在腎透明細胞癌中的作用即是本文研究中的重點。
　　 實驗方法:
　　 1.采用lncRNAs芯片技術，將腎癌患者根據(jù)臨床分期分為兩組:轉(zhuǎn)移組(T3M1N0)組

3、和非轉(zhuǎn)移組(T1aM0N0)，分別取腎癌原發(fā)灶腫瘤組織，篩選差異表達的lncRNAs;
　　 2采用RT-PCR技術檢測在腎透明細胞癌腫瘤組織以及癌旁非腫瘤組織中MARCCT-1的表達情況，研究其與臨床分級、病理分級、遠處轉(zhuǎn)移之間的關系。
　　 3.采用RNAi特異性抑制A498細胞中MARCCT-1的表達后，以CCK8法、AnnexinV/PI雙染法、Transwell侵襲實驗和劃痕實驗分別觀察細胞增殖、凋亡及侵襲遷移

4、能力的變化。
　　 結果:
　　 1.篩選出320個與腎透明細胞癌遠處轉(zhuǎn)移相關的差異表達lncRNA，其中114個lncRNA在出現(xiàn)腫瘤遠處轉(zhuǎn)移時表達上調(diào)，206個lncRNA在腫瘤遠處轉(zhuǎn)移時表達下調(diào)。
　　 2.采用RT-PCR方法檢測腫瘤與配對癌旁非腫瘤組織，腫瘤組織中的MARCCT-1表達在78.6％（11例）的樣本中上調(diào)，在21.4％（3例）例樣本中下調(diào)，其中ccRCC中MARCCT-1的相對表達量為3.

5、52×10-2±5.20×10-2，癌旁非腫瘤組織中的相對表達量為0.106±0.165，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MARCCT-1表達水平較高。根據(jù)病理分級進行分組，高分化組MARCCT-1在癌組織中相對癌旁組織的表達倍數(shù)為7.66±12.19，中-低分化組為10.29±11.98，沒有顯著差異。在不同臨床分期樣本中，Ⅰ期MARCCT-1在癌組織中相對癌旁組織的表達倍數(shù)為10.53±14.19，Ⅱ～Ⅳ期為7.41±9.45，沒有顯著差異，提示其表

6、達水平可能與臨床分期和病理分級無明顯關系。根據(jù)有無遠處轉(zhuǎn)移分組樣本中，無遠處轉(zhuǎn)移組MARCCT-1在癌組織中相對癌旁組織的表達倍數(shù)為5.50±9.94，有遠處轉(zhuǎn)移組為21.70±9.24，發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移組中MARCCT-1表達水平較高。
　　 3.采用CCK-8法觀察用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細胞中MARCCT-1表達后，結果顯示在48、72、96小時后，對A498細胞增殖的抑制率分別為16.95％、18.7

7、7％、17.73％，發(fā)現(xiàn)對細胞增殖具有明顯抑制作用。
　　 4.采用流式細胞術檢測用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細胞中MARCCT-1表達后，發(fā)現(xiàn)對細胞凋亡無明顯作用。
　　 5.采用Transwell侵襲實驗檢測用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細胞中MARCCT-1表達后，結果顯示侵襲細胞數(shù)對照組704.3±82.4，轉(zhuǎn)染組361.7±12.6，發(fā)現(xiàn)對細胞侵襲具有明顯抑制作用。

8、　　 6.采用劃痕實驗檢測用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細胞中MARCCT-1表達后，發(fā)現(xiàn)對細胞遷移具有明顯抑制作用。
　　 結論:
　　 1、發(fā)現(xiàn)了300多個可能與腎透明細胞癌癌侵襲轉(zhuǎn)移相關的候選lncRNAs。
　　 2、腎透明細胞癌患者癌組織中的MARCCT-1的表達水平較癌旁非腫瘤組織明顯上調(diào)，提示MARCCT-1表達的上調(diào)可能與腎透明細胞癌的發(fā)病機制相關。
　　 3、在腎透明

9、細胞癌患者中，有遠處轉(zhuǎn)移患者癌組織相對癌旁組織的MARCCT-1表達水平較無遠處轉(zhuǎn)移組高，提示MARCCT-1的表達上調(diào)可能與ccRCC的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關，MARCCT-1的表達水平與ccRCC的病理分級及臨床分期組合無顯著相關性。
　　 4、MARCCT-1 siRAN能有效的轉(zhuǎn)染于A498細胞，降低A498細胞中MARCCT-1的表達。
　　 5、降低MARCCT-1的表達能使A498細胞增殖能力受到抑制，同時細胞的