植酸酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其應(yīng)用.pdf

1、植酸酶作為飼料添加劑受到廣泛關(guān)注，其發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用值得研究。 試驗(yàn)首先研究了畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)黑曲霉源植酸酶，比較了中試生產(chǎn)過(guò)程中不同發(fā)酵時(shí)間、pH值、溶氧、菌體濃度、銨氮對(duì)酶活的影響，同時(shí)比較五種不同來(lái)源植酸酶在不同pH值，不同溫度條件下的酶活特性、耐酸穩(wěn)定性和蛋白酶對(duì)其降解作用。結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間、pH值、溶氧、菌體濃度、銨氮與酶活關(guān)系密切。本試驗(yàn)所用菌種發(fā)酵的植酸酶與其它五種不同來(lái)源的植酸酶在pH值、溫度、耐酸性、抗蛋

2、白酶的降解破壞等方面，因菌種的差異略有差異。 對(duì)大腸桿菌源的基因工程菌appA進(jìn)行高密度發(fā)酵，比較10批產(chǎn)品酶活的變化，制定生產(chǎn)工藝流程，同時(shí)對(duì)產(chǎn)植酸酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，利用該工藝進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)10批產(chǎn)品，酶活的變化差異不大，具有相對(duì)的穩(wěn)定性。該重組植酸酶appA的最適pH為4.5，最適溫度為60℃，在pH2-7之間酶活均能維持在80％以上，具有很好的pH穩(wěn)定性；在60℃下保溫30min，剩余酶活性為40％：C

3、a<'2+>、Fe<'2+>、Mg<'2+>Mn<'2+>及EDTA對(duì)AppA有輕微的激活作用，酶活性分別促進(jìn)12.2％、4.5％、13.8％、13.4％及16.9％；其余金屬離子Zn<'2+>、Cu<'2+>、Ba<'2+>對(duì)AppA的酶促反應(yīng)均有不同程度的抑制作用，分別抑制65.4％、55.3％及8.2％，SDS抑制植酸酶活性23.7％：具有非常好的抗胃蛋白酶水解能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力。 植酸酶活性體外評(píng)價(jià)的試驗(yàn)采用

4、無(wú)淀粉麩皮，在37℃，保溫12h，比較植酸酶在pH為5.5、5.0、4.0、2.6過(guò)程中無(wú)機(jī)磷的溶出情況，結(jié)果顯示，無(wú)機(jī)磷的溶出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、pH的升高而增大。同時(shí)確立了無(wú)淀粉麩皮的植酸酶酶解的基本方法，評(píng)價(jià)了15種商品植酸酶在不同pH值下對(duì)植酸磷的釋放。結(jié)果顯示酶活測(cè)定在較為粗略的程度上還是有很重要的作用，測(cè)定10000U/g酶活的植酸酶在上述4個(gè)pH值上所產(chǎn)生的磷的量比5 000U/g酶活的植酸酶高；單個(gè)酶樣中的pH圖譜中能夠清晰

5、看出在4個(gè)pH值的酶，從而可以推測(cè)該酶在體內(nèi)不同消化環(huán)境中的酶學(xué)活性的變化，從而尋求與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)的相關(guān)性。比較不同產(chǎn)品的酶學(xué)特性，顯示康地恩植酸酶的酶學(xué)特性較好，在偏堿性pH值的表現(xiàn)在同類(lèi)產(chǎn)品中最好，在酸性條件下也不遜色于其他產(chǎn)品，有利于植酸酶在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用。 大腸桿菌源的植酸酶appA中試生產(chǎn)應(yīng)用研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室中該酶具有較高的比活性，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。但是，該工程菌移植工廠生產(chǎn)后，由于設(shè)備工藝等諸多方面的條

6、件限制，發(fā)酵液效價(jià)未能達(dá)到技術(shù)要求，通過(guò)對(duì)該植酸酶工程茵的工藝進(jìn)行改進(jìn)，可獲得更高的酶活。液態(tài)植酸酶的穩(wěn)定性試驗(yàn)，選用大分子有機(jī)物、醇類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸等為備選試劑，分別進(jìn)行單因子的不同濃度篩選，比較不同試劑對(duì)該重組植酸酶AppA熱穩(wěn)定性的影響。在此基礎(chǔ)上，篩選具備高效保護(hù)作用的試劑進(jìn)行組合，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)合因子實(shí)驗(yàn)，選取最佳組合。復(fù)合組合的穩(wěn)定劑保護(hù)效果較好，確保該重組植酸酶AppA液體酶制劑在25℃1個(gè)月內(nèi)剩余酶活>95％。

7、 為解決飼料廠使用植酸酶時(shí)高溫制粒對(duì)酶活的不利影響，采用液體植酸酶后噴涂工藝及KDN-MPPM液態(tài)酶后噴涂設(shè)備，用于全價(jià)飼料加工過(guò)程中，向飼料顆粒表面噴涂微量液態(tài)酶制劑，在設(shè)備的基礎(chǔ)上組合形成液體植酸酶的應(yīng)用系統(tǒng)。后噴涂的精確度和均勻度是該工藝的關(guān)鍵，精確度較易控制，但均勻度涉及噴霧的壓力、噴嘴結(jié)構(gòu)、飼料和酶的稱量傳感器精度及其平行對(duì)應(yīng)控制，是系統(tǒng)的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)飼料中植酸酶的檢測(cè)證實(shí)，7000U/ml的植酸酶按萬(wàn)分之一添加到顆粒飼料

8、中，每克顆粒飼料含酶0.7u，無(wú)法用常規(guī)方法檢出。但通過(guò)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提高酶解率，能較好地檢出顆粒飼料中微量植酸酶。霧化后噴涂的酶液，均勻度很高，CV％<10％，完全滿足飼料均勻度需要，并可檢出飼料中植酸酶含量。 試驗(yàn)選用216只300日齡羅曼產(chǎn)蛋雞，比較飼料中不添加植酸酶與添加0.06％的植酸酶對(duì)基礎(chǔ)日糧中磷酸氫鈣和磷的用量的影響。結(jié)果表明：基礎(chǔ)日糧中若不添加植酸酶，則降低有效磷含量會(huì)影響雞只的生產(chǎn)性能。添加0.06％植酸酶后

9、，飼料配方中總磷即使為0.44％，只要日采食糧>113克，該酶仍能起到分解飼料中植酸磷的作用，蛋雞的生產(chǎn)性能不受影響。 比較植酸酶對(duì)肉仔雞免疫功能、腸道菌群及生產(chǎn)性能的影響，選用120只1日齡雙AA肉雞，雌雄各半，在營(yíng)養(yǎng)水平相同的情況下比較使用植酸酶日糧與普通日糧的雞群在1-42日齡出欄時(shí)各生長(zhǎng)階段肉雞的生產(chǎn)性能、淋巴細(xì)胞比率、免疫器官指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量的差異。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組添加0.6％植酸酶后，

10、前中后三期日糧配方中磷酸氫鈣用量較對(duì)照組分別降低18.8％、24％和36％；添加植酸酶后，試驗(yàn)組較對(duì)照組平均日增重提高12％，其中雌性試驗(yàn)組與雌性對(duì)照組相比出欄體重增加396克，平均日增重提高22.6％，表現(xiàn)差異極顯著；植酸酶的使用能夠有效降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，雄性植酸酶組在不同日齡段大腸桿菌數(shù)量降幅分別達(dá)到23％，34％和50％，雌性植酸酶組降幅平均達(dá)到50％。本試驗(yàn)顯示添加植酸酶后肉雞巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、免疫器官指數(shù)均出現(xiàn)不同程度下降

11、。 采用1620只36～44周齡的產(chǎn)蛋雞進(jìn)行30天試驗(yàn)，比較相同基礎(chǔ)日糧中添加五種不同來(lái)源的植酸酶在日產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重、日破蛋數(shù)、破蛋數(shù)、周耗料、料蛋比、死淘率方面的差異。結(jié)果表明，組間的總采食量、總產(chǎn)蛋量及總產(chǎn)蛋重差異皆不顯著；BF、XP和康地恩植酸酶用于產(chǎn)蛋雞飼料的效果差異也都不顯著。其中平均產(chǎn)蛋率以康地恩酶組效果最優(yōu)(91.27％)，較對(duì)照組提高了3.56％。其它處理組差異較小。全期料蛋比以BF組最低；而對(duì)照組、CH酶、X

12、P三個(gè)處理組最高，比BF組提高了1.70％。全期破蛋數(shù)(枚)對(duì)照組和xP兩個(gè)處理組極顯著高于其它處理組，以XP和CH酶兩個(gè)處理組最低。全期雞只死淘數(shù)仍以對(duì)照組和XP兩個(gè)處理組微高，其它處理組接近。 參考營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和植酸酶的潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并結(jié)合當(dāng)前原料市場(chǎng)價(jià)，比較添加植酸酶前后肉雞、肉鴨料配方變化帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益的變化，表明添加組肉雞料每噸可節(jié)省成本9.47-11.51元，肉鴨料每噸節(jié)省成本4.51-7.85元，對(duì)月產(chǎn)一萬(wàn)噸全價(jià)禽料廠進(jìn)