HPLC測定膽固醇代謝酶(CYP7A1)活性方法學(xué)的建立.pdf

1、背景:膽汁酸是在肝細(xì)胞內(nèi)由游離膽固醇生成的,第一步及限速反應(yīng)是膽固醇在膽固醇7α-羥化酶的作用下進(jìn)行的7α-羥化作用。膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)位于微粒體,屬細(xì)胞色素P450酶系。據(jù)報道,它的活性受膽汁酸池體積、組成和疏水性,膽汁酸的腸肝循環(huán),激素、腸道因子以及各種調(diào)節(jié)CYP7A1轉(zhuǎn)錄的核受體的表達(dá)的負(fù)反饋作用所影響。
　　 測定膽固醇7α-羥化酶活性的方法主要有三種:(1)用薄層色譜技術(shù),采用同位素結(jié)合法將放射性標(biāo)記的

2、膽固醇與7α-羥膽固醇分離;(2)GLC-MS法;(3)用HLPC-分光光度法。
　　 用高效液相色譜法(HPLC)測定CYP7A1酶活性的基本原理是在肝微粒體的催化下,內(nèi)源性膽固醇作為膽固醇7α-羥化酶的底物,適合的反應(yīng)溫度、時間等因素協(xié)同作用下,生成7α-羥膽固醇;我們通過加入膽固醇氧化酶后將7α-羥膽固醇轉(zhuǎn)化為7α-羥-4-膽甾烯-3-酮(HCO),然后用HPLC對7α-羥膽固醇進(jìn)行定量。以HCO產(chǎn)物量的多少來判斷該CYP

3、7A1活性的大小。本研究對前有的研究方法進(jìn)行了改進(jìn),其一是采用了7β-羥膽固醇作為內(nèi)標(biāo),其二是采用反相HPLC法對酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離與定量。
　　 目的:對大鼠肝微粒體中膽固醇代謝酶(CYP7A1)活性測定方法的建立。在本研究中,我們采用反相液相色譜法(RP-HPLC)來測定膽固醇7α-羥化酶的活性。方法:采用XDB-C18(4.6×250mm,5μm)色譜柱;柱溫為室溫:以乙腈-甲醇(95:5)為流動相,流速:0.8mL/mi

4、n;檢測器為可變波長掃描紫外檢測器(VWD),VWD=240nm。以7β-羥膽固醇為內(nèi)標(biāo)與大鼠的肝微粒體進(jìn)行體外孵育,以反相液相色譜法測定膽固醇的反應(yīng)產(chǎn)物7α-羥-4-膽甾烯-3-酮(HCO)。
　　 結(jié)果:
　　 1.以待測物濃度為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),求得線性回歸方程,結(jié)果為:Y=1.31362786X+0.0268326,R2=0.99603。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,7α-羥膽固醇的線性范圍為10-50