小兒急性白血病microRNA表達(dá)譜及miR-125b的功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，其長度為19到25個核苷酸，在真核生物的多種發(fā)育和生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，約有50％的已注釋人類的miRNA位于脆性位點(diǎn)和跟癌癥發(fā)生相關(guān)的基因區(qū)，并且起著腫瘤抑制基因和癌基因的功能。此外，在很多癌癥包括白血病中已經(jīng)鑒定到與診斷、發(fā)展、預(yù)后及治療反應(yīng)相關(guān)的miRNA表達(dá)譜。白血病是一種血液或骨髓的癌癥，是由血細(xì)胞的異常增殖引起的。小兒與成人白血病在臨床和生物學(xué)特

2、性、治療反應(yīng)、治愈率以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤類型等方面有著明顯的不同。同許多成人白血病的研究相比，小兒白血病相關(guān)miRNA的表達(dá)特點(diǎn)及功能研究較少。而且，能否用基于miRNA的方法來更加準(zhǔn)確地診斷小兒白血病尚待研究。 在本研究中，我們總共收集了有臨床資料的212例小兒急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)病例以及12例小兒正常對照樣品進(jìn)行小兒急性白血病miRNA相關(guān)的研究，其中38例病例和7例對照用于miRNA芯片

3、分析，剩余174例樣品和5例正常對照用于qRT—PCR驗(yàn)證及進(jìn)一步的miRNA功能研究，獲得了如下重要結(jié)果： (1) MiRNA芯片結(jié)果揭示存在小兒白血病特異性的miRNA表達(dá)譜。我們首先對36例小兒急性白血病患者的576個人類成熟miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，篩選并獲得了一批小兒特異性表達(dá)的miRNA分子，如miR-125b、miR—34a、miR-18b、miR—28、miR—331、miR—505等，這些miRNA的表達(dá)與

4、成人明顯不同，揭示了小兒白血病中存在著與成人不同的、小兒特有的miRNA表達(dá)譜。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，在小兒ALL中特異高表達(dá)的miRNA有miR—34a、miR-128a、miR-128b和miR-146a，而在小兒AML中特異高表達(dá)的miRNA是miR-100、miR-125b、miR—335、miR-146a和miR—99a等，表明miRNA表達(dá)譜可以區(qū)分小兒ALL和小兒AML。在miRNA表達(dá)譜分析的基礎(chǔ)上，我們結(jié)合臨床資料分析獲

5、得了跟小兒ALL危險度、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)復(fù)發(fā)相關(guān)、強(qiáng)的松反應(yīng)以及小兒ALL復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNA表達(dá)模式，這些表達(dá)譜為小兒個體化治療提供新的思路。 (2) MiRNA表達(dá)譜與小兒AML的分型和預(yù)后有關(guān)。AML是一種急性髓細(xì)胞白血病，可以根據(jù)細(xì)胞發(fā)育和成熟程度分為M0到M7八個亞型。采用非監(jiān)督聚類方法對miRNA芯片進(jìn)行分析，結(jié)果表明，miRNA表達(dá)譜可以有效區(qū)分M1、M2和M3亞型，部分特異性表達(dá)的miRNA分子進(jìn)一步得到q

6、RT—PCR結(jié)果的驗(yàn)證，如miR—335在M1中高表達(dá)，miR-126在M2中高表達(dá)，而miR-125b則在M3(又稱為acute promyelocytic leukemia APL)中高表達(dá)。值得注意的是，miR-125b在APL中的表達(dá)上調(diào)約200倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AML其它亞型，暗示了miR-125b可能在小兒APL的發(fā)生中起著重要的作用。本研究又進(jìn)一步在大量的APL臨床樣本中對miR-125b的表達(dá)進(jìn)行了檢測，其中包括82例小兒AP

7、L初發(fā)患者、33例完全緩解(CR)樣品、3例未緩解(NR)樣品及4例復(fù)發(fā)樣品。結(jié)果表明，miR-125b在所有82例小兒APL亞型初發(fā)患者中顯著高表達(dá)，在90％的治療后緩解樣品中的表達(dá)量下降，幾乎與正常對照中的表達(dá)相同，而在未緩解患者中盡管比治療前稍低但仍然比正常對照高。這些結(jié)果揭示了miR-125b參與了APL的發(fā)生，可以用來評估預(yù)后和化療效果。 (3) MiR-125b通過調(diào)控靶基因BAK1發(fā)揮了癌基因功能。為了進(jìn)一步研究m

8、iR-125b的功能，我們又運(yùn)用TargetScan軟件對miR-125b的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，選擇了幾個可能的靶基因。通過雙熒光報告轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了BAK1就是miR-125b的靶基因。BAK1屬于BCL2蛋白家族，其功能是誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。對122例APL患者進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，在正常對照和60％的CR樣本中BAK1蛋白表達(dá)較高，miR-125b表達(dá)較低，而在70％的未治療和所有NR的APL患者中BAK1蛋白

9、表達(dá)較低，miR-125b表達(dá)較高，表明在APL患者中miR-125b的表達(dá)與其靶基因BAK1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，調(diào)控了BAK1蛋白的表達(dá)。此外，用100nM miR-125b mimics轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞后BAK1的表達(dá)明顯降低，而且MTT實(shí)驗(yàn)表明miR-125b明顯促進(jìn)了NB4細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果有力地揭示了miR-125b在APL中起著癌基因的作用，能夠促進(jìn)APL的發(fā)展，該研究不僅闡明了小兒APL新的致病機(jī)制，而且還為以miR-12