Investigation into the Functional Significance of Precusor Messenger Rna Processing Factor 19(Prp19)gene Upregulation in Human.pdf

1、目的:癌癥是由于細(xì)胞異常(增)(殖)而引起的。癌癥細(xì)胞可以通過(guò)血管和淋巴管由原發(fā)部位向遠(yuǎn)端侵襲，如果這種侵襲無(wú)法被抑制則最終會(huì)導(dǎo)致死亡。肺癌是高發(fā)的癌癥之一，其每年的全球致死率都名列前茅。肺腺癌是肺癌的一種常見類型，其發(fā)病率大約占40％。然而，早期診斷和有效的治療并不能完全將其根治。因此，如果能從新的方向入手，找到特異性的靶點(diǎn)，將會(huì)為其治療帶來(lái)新的曙光。
　　信使RNA前體加工因子19(PRP19)編碼一個(gè)55kDa的蛋白PRP1

2、9。該蛋白廣泛存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。PRP19在原核和真核細(xì)胞中分別位于NineTeen復(fù)合物(NTC)和PRP19/Cdc5復(fù)合物中，能夠與其他蛋白如細(xì)胞分裂循環(huán)5樣蛋白(Cdc5L)、Werner綜合征RecQ解旋酶樣蛋白(WRN)和剪接體相關(guān)蛋白因子27(Spf27)相互作用。PRP19的功能主要有:(1)mRNA剪接，(2)泛素化，(3)DNA損傷修復(fù)，(4)轉(zhuǎn)錄延伸和(5)維持細(xì)胞核網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
　　PRP19參與多種疾病

3、及癌癥的發(fā)生。例如，某些與泛素蛋白酶活性缺失相關(guān)的癌癥的發(fā)生以及因異常剪接突變而改變基因E3連接酶活性而導(dǎo)致的癌癥等。這些改變會(huì)導(dǎo)致多條重要的信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常、關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子功能退化而使癌蛋白功能(增)強(qiáng)，同時(shí)也會(huì)使其他細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子如NF-κB、C-Myc，N-Myc和Src樣蛋白功能異常。此外，上述異常同樣會(huì)引起腫瘤抑制蛋白如p53和p27的退化。在體外，PRP19表達(dá)上調(diào)具有多種積極的作用，包括抗衰老和延長(zhǎng)生命周期。

4、這些特性取決于PRP19的DNA損傷修復(fù)能力。PRP19在體外的上調(diào)表達(dá)會(huì)(增)加其對(duì)凋亡的耐受能力，同時(shí)會(huì)(增)加p53的磷酸化程度，最終引起細(xì)胞生命期的延長(zhǎng);而PRP19表達(dá)下調(diào)，其抵御凋亡的能力明顯降低。
　　方法:分別采用免疫組化、westernblotting(anti-PRP19抗體)和real-timePCR的方法，檢測(cè)PRP19在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位。以肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為體外模型進(jìn)行轉(zhuǎn)染

5、。轉(zhuǎn)染后，對(duì)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、毒性耐受力和凋亡能力進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組分別為轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞。
　　結(jié)果與討論:PRP19廣泛分布于肺腺癌組織中，并且其在癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。組織芯片結(jié)果表明，172例肺癌組織中（66例原發(fā)型肺癌，53例轉(zhuǎn)移型肺癌和53例正常組織）PRP19在癌組織中陽(yáng)性率為78％，癌旁組織陽(yáng)性率43％，p＜0.001。肺癌組織中,PRP19在mRNA水平的表達(dá)量是癌旁組織的20倍(

6、p＜0.001)。過(guò)表達(dá)PRP19的肺腺癌細(xì)胞中，參與基因組損傷修復(fù)的p53表達(dá)下調(diào)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的p21表達(dá)上調(diào)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、CCK-8增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，PRP19過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力、增殖能力均顯著低于對(duì)照組。小鼠成瘤性實(shí)驗(yàn)同樣表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠(A549-pEX-PRP19)經(jīng)注射后腫瘤形成時(shí)間較長(zhǎng)，大約為25±1天;而對(duì)照組的致瘤時(shí)間為18±1.4天(p=0.021)。注射6周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤大小為164

7、±79mm3，對(duì)照組小鼠腫瘤大小為562±173mm3。PRP19過(guò)表(達(dá))會(huì)顯著抑制細(xì)胞凋亡。DAPI染色結(jié)果表明，顧鉑處理24h后處于凋亡的第一階段和第二階段的對(duì)照組細(xì)胞明顯多于實(shí)驗(yàn)組;48h時(shí)，對(duì)照組有76.6±2.8％的細(xì)胞處于凋亡的第二階段和第三階段，而實(shí)驗(yàn)組有59.3±2.1％的細(xì)胞處于凋亡的第一階段和第二階段，第三階段的細(xì)胞數(shù)量最少。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相似，相同時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）明顯少于對(duì)照組。

8、經(jīng)順鉑處理48h后，同一視野下對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均值為84±11，實(shí)驗(yàn)組為45±8(p＜0.001)。隨后，我們用westernblotting檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。其中，兩組中Bax表達(dá)無(wú)明顯差異;實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2的表達(dá)顯著增加而Caspase3的表達(dá)則明顯減弱。這說(shuō)明，PRP19過(guò)表達(dá)抑制凋亡可能是通過(guò)提高Bcl-2的表達(dá)使其發(fā)揮抗凋亡作用;同時(shí)又可以降低凋亡執(zhí)行者Caspase3的表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)凋亡進(jìn)行抑制。