骨髓來源的肥大細胞(BMMC)表面FcεRI表達調(diào)控及其生物學活性的研究.pdf

1、實驗目的
　　 肥大細胞主要存在于粘膜和結締組織中,借助于其表面表達的IgE的高親合力受體FceRI與抗變應原的特異性抗體IgE的交聯(lián),形成IgE/FcεRI復合物,進而引發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應。肥大細胞胞漿中存在大量顆粒,其內(nèi)儲存組胺等生物介質,活化的肥大細胞也可新合成細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-13等生物介質。
　　 為此,本研究擬利用Elf-1 siRNA轉染技術和體外TSA刺激等方式,探討轉錄因子Elf-1和組

2、蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對小鼠骨髓來源的肥大細胞(BMMC)表面FcεRI基因表達及其生物學功能的調(diào)控作用機制。進而,為肥大細胞相關的變態(tài)反應的研究提供新的實驗依據(jù)。
　　 實驗方法
　　 一、小鼠BMMC的制備
　　 BALB/c小鼠,雌性,6-8周齡。鈍性分離小鼠雙側股骨,用1ml注射器吸取少量RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗骨髓內(nèi)細胞至無菌平皿中。收集液體至10ml離心管中,1000rpm,4℃離心5min,

3、棄上清。用10mlBMMC培養(yǎng)液重懸細胞,移至10cm無菌培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)。
　　 二、Elf-1 siRNA和Elf-1表達質粒體外轉染
　　 按照Mouse Macrophage Nucleofector試劑盒說明操作,選擇Y-001程序,分別將20μM Elf-1 siRNA、Control siRNA和FITC-標記的寡核苷酸經(jīng)電轉至小鼠1×106 BMMC中,37℃分別培養(yǎng)24h(待試劑盒轉染效率、Elf-1

4、 mRNA表達和FcεRIα、β、γ-鏈mRNA表達檢測)和48h(待Elf-1蛋白表達檢測)。同法將1μgpGV-B2-αNN0.6或pGL3-Basic分別與25ng pRL-CMV(內(nèi)參)和20μM Elf-1siRNA/Control siRNA共同電轉染至1×106BMMC中；另將5μgpGV-B2-αNN0.6或pGL3-Basic分別與25ng pRL-CMV(內(nèi)參)和10μg pCR3.1-Elf-1或對照pCR3.1經(jīng)

5、Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ電轉染至BMMC中,37℃孵育24h后,收集BMMC(待FcεRI α-鏈啟動子熒光素酶活性的分析)。
　　 三、Elf-1表達鑒定
　　 收集24h Elf-1及Control siRNA核轉染的BMMC,按照RNeasy(R)Micro試劑盒的說明,提取細胞總RNA,利用High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒反轉錄合成cDNA第

6、一鏈,利用TaqMan Universal PCR Master Mix和7500Real-time PCR儀進行Real-time PCR,分析靶基因Elf-1 mRNA表達。Elf-1引物為(Mm00468217_m1)。另收集48h Elf-1及Control siRNA轉染的BMMC,裂解細胞后,經(jīng)7.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉膜1.5h后,用anti-Elf-1 Ab和anti-actinAb作為第一抗體4℃過夜孵育。

7、洗膜后用Alexa Fluor 680 goat anti-rabbit IgG和IRDye 800 goat anti-mouse IgG分別作為抗Elf-1和actin的第二抗體進行孵育1h,洗膜后用Odyssey infrared imaging system檢測Elf-1蛋白的表達。
　　 四、BMMC FcεRI α-鏈啟動子活性檢測
　　 收集轉染后的BMMC,按照Dualluciferase assay試劑

8、盒說明,經(jīng)Micro LumatPlus分析FcεRl α-鏈啟動子熒光素酶活性。
　　 五、FcεRIα-、β-和γ-鏈mRNA表達水平的檢測
　　 收集Elf-1 siRNA/Control siRNA轉染后的BMMC。利用RNeasy Micro Kit提取總RNA,利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA第一鏈,利用TaqMan Universal

9、PCR Master Mix和7500 Real-Time PCR System withTaqMan Gene Expression,進行Realtime PCR,分析靶基因α-鏈(Mm00438867_m1)、β-鏈(Mm00442780_ml)和γ-鏈(Mm00438869_g1)mRNA表達水平。
　　 六、PU.1結合FcεRI α-鏈啟動子能力檢測
　　 收集Elf-1 siRNA/Control siRNA

10、轉染后的BMMC,經(jīng)超聲破碎細胞,沉淀染色質DNA。再分別與Anti-PU.1 goat Ab和goat IgG 4℃孵育1h后,經(jīng)7500 RealtimePCR System分析PU.1結合FcεRI α-鏈啟動子的能力。所用引物為小鼠FcεRI α-鏈啟動子(-82/+1):正義鏈-82/-56(5’-GGCATAGCTGATGAGTTAACCAGATAC-3’),反義鏈+1/-22(5’-TATGGETTCGAAAATAGGCT

11、TGA-3’)和TaqMan probe-51/-33(5’-FAM-CAGAAGACATTTCCTTCTC-MGB-3’)。
　　 七、TSA體外刺激BMMC
　　 調(diào)制正常小鼠BMMC濃度至1×106/ml,經(jīng)0,2,10,或50 nMTSA 37℃孵育24h(待BMMC FcεRI表達和功能檢測)或48h(待BMMC凋亡檢測)。
　　 八、BMMC表面FcεRI表達檢測
　　 收集Elf-1 siR

12、NA/對照siRNA轉染的BMMC或TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)2.42G阻斷細胞表面Fc受體后,再與PE-anti FcεRI α-鏈抗體4 ℃避光孵育1h,PBS洗細胞2遍,用FACSCalibur流式細胞儀分析細胞表面FcεRI表達。
　　 九、BMMC凋亡檢測
　　 收集TSA體外刺激48h的BMMC,經(jīng)5μg/ml propidium iodide(PI)和AnnexinV-FITC(BD Bioscience

13、s)室溫染色15min后,FACSCalibur流式細胞儀分析BMMC的凋亡情況。
　　 十、肥大細胞脫顆粒能力檢測
　　 收集不同濃度TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)1μg/ml IgE 4℃致敏1h,重懸于Tyrode’s緩沖液中,1×106/ml,再經(jīng)1μg/ml anti-IgE 37℃刺激45min后,收集上清液。加入p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside作為底物37℃

14、顯色90min后,經(jīng)酶標儀測定OD405值(ODsample)。IgE致敏細胞經(jīng)2％Triton處理的培養(yǎng)上清液的OD值作為細胞顆粒的最大釋放量(ODtotal)。IgE致敏細胞經(jīng)Typrode’s緩沖液孵育的上清液的OD值為ODbase()β-氨基己糖苷酶的釋放量(％)=(ODsample-ODbase)/(ODtotal-ODbasw)×100％。
　　 十一、BMMC分泌合成IL-6檢測
　　 TSA體外刺激的BM

15、MC,經(jīng)1μg/ml IgE/anti-IgE體外刺激1h后,提取細胞總RNA,反轉錄成cDNA,經(jīng)Realtime PCR檢測IL-6mRNA水平；經(jīng)體外刺激3h或6h后,收集培養(yǎng)上清,按照IL-6 ELISAkit說明,檢測上清中IL-6分泌水平。
　　 十二、BMMC IL-6啟動子上組蛋白乙酰化水平檢測
　　 TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)1μg/ml IgE/anti-IgE體外刺激30min后,超聲破碎細胞,沉

16、淀染色質DNA。再與Anti-acetyl-histone H3 rabbit IgG、anti-acetyl-histoneH4 rabbit antiserum或rabbit IgG 4℃孵育1h后,經(jīng)7500 Realtime PCRSystem(Applied Biosystems)分析乙酰化組蛋白H3和H4結合IL-6啟動子的能力。所用引物為小鼠IL-6啟動子(-84/-9):正義鏈IL-6-84F(5’-CCCATGAGTC

17、TCAAAATTAGAGAGTTG-3’),反義鏈IL-6-9R(5’-CAGAGCAGAATGAGCTACAGACATC-3’)和TaqMan probe IL-6-56P(5’-CTCCTAATAAATATGAGACTGGG-3’)。
　　 結論
　　 1、小鼠巨噬細胞核轉染試劑盒(Amaxa)同樣適用于小鼠BMMC的核酸轉染。
　　 2、Elf-1 siRNA可特異性降低小鼠BMMC的Elf-1表達。

18、>　　 3、Elf-1通過抑制PU.1與α-鏈啟動子之間的結合,抑制小鼠BMMC FcεRI α-鏈啟動子的活性和轉錄。
　　 4、Elf-1可抑制小鼠BMMC FcεRI α-鏈mRNA的表達,但對β-和γ-鏈的轉錄未見有意義的影響。
　　 5、Elf-1單獨作用尚不能影響小鼠BMMC FcεRI的表面表達。
　　 6、TSA以劑量依賴方式抑制FcεRI-介導的BMMC活化。
　　 7、50nM TS